Кош тилкелүү РНК (dsRNA) ELISA КИТ

Бул комплект биотин-Стрептавидин системасы менен энзим менен байланышкан иммуносорбент анализи (ELISA) ырааттуулугуна карабастан узундугу 60 базалык жуптан (bp) жогору dsRNAны сандык өлчөө үчүн.Пластинка анти-dsRNA антитело менен алдын ала капталган.Үлгүдө бар dsRNA кошулат жана скважиналарга капталган антителолор менен байланышат.Анан биотинилденген анти-dsRNA антитело кошулат жана үлгүдөгү dsRNA менен байланышат.Жуугандан кийин, HRP-Стрептавидин кошулат жана биотинилденген анти-dsRNA антитело менен байланышат.Инкубациядан кийин байланышпаган HRP-стрептавидин жуулат.Андан кийин TMB субстрат эритмеси кошулуп, HRP тарабынан катализделет жана кислоталык токтотуучу эритме кошулгандан кийин сары болуп өзгөргөн көк түстүү продукт пайда болот.Сары түстүн тыгыздыгы пластинкада алынган dsRNAнын максаттуу суммасына пропорционалдуу.Абсорбенс 450 нмде өлчөнөт.

Колдонмо

Бул комплект калдык dsRNA сандык өлчөө үчүн.

Комплекттин компоненттери

Сактоо жана туруктуулук

1. Колдонулбаган комплект үчүн: Бүт комплект 2~8℃ жарактуулук мөөнөтүндө сакталышы мүмкүн.Сактоо туруктуулугу үчүн күчтүү жарыктан оолак болуу керек.

2. Колдонулган комплект үчүн: Микропластинаны ачкандан кийин, пайдаланылбаган скважиналарды пластинка пломбалоочу менен жаап, кургаткыч таңгагын камтыган фольга баштыгына кайтыңыз, фольга баштыгын сыдырма менен бекитиңиз жана колдонгондон кийин мүмкүн болушунча тезирээк 2~8℃ температурасына кайтыңыз.Башка реагенттер колдонулгандан кийин мүмкүн болушунча тезирээк 2~8℃ температурасына кайтарылышы керек.

Материалдар талап кылынган, бирок берилген эмес

1. 450 ± 10 нм чыпкасы бар микропластинаны окугуч (эгерде 450 жана 650 нм толкун узундугунда аныктай алса жакшы).

2. Микропластинаны чайкагыч.

3. RNase жок учтар жана центрифуга түтүктөр.

Операциянын схемасы

Баштоодон мурун

1. Колдонуудан мурун комплекттин бардык компоненттерин жана үлгүлөрүн бөлмө температурасына (18-25℃) алып келиңиз.Эгерде комплект бир убакта колдонулбаса, анда ушул эксперимент үчүн тилкелерди жана реагенттерди гана чыгарып, калган тилкелерди жана реагенттерди талап кылынган абалда калтырыңыз.

2. Жуу буфери: 800 мл 1× жуу буферин даярдоо үчүн 40 мл 20 × концентрацияланган жуу буферин 760 мл деионизацияланган же дистилденген суу менен суюлтуңуз.

3. Стандарттык: колдонуудан мурун камдык эритмени кыскача айлантыңыз же центрифугалаңыз.Берилген төрт стандарттын концентрациясы 5нг/мкл.UTP жана pUTP dsRNA стандарттары үчүн стандарттык ийри сызыкты сызуу үчүн запастык эритмени 1,0,5,0,25,0,125,0,0625,0,0312,0,0156,0pg/мкл STE буфери менен суюлтуңуз.N1-Me-pUTP dsRNA стандарттары үчүн стандарттык ийри сызыкты тартуу үчүн запастагы эритмени 2,1,0,5,0,25,0,125,0,0625,0,0312, 0pg/μL STE буфери менен суюлтуңуз.5-OMe-UTP dsRNA стандарты үчүн стандарттык ийри сызыкты тартуу үчүн запастык эритмени 4,2,1,0,5, 0,25,0,125,0,0625, 0пг/мкл STE буфери менен суюлтуңуз.Биз стандарттарды төмөнкү диаграммалар катары суюлтууну сунуштайбыз:

4. Биотинделген аныктоочу антитело жана HRP-стрептавидин жумушчу эритмеси: колдонуудан мурун запас эритмени кыскача айлантыңыз же центрифугалаңыз.Аларды суюлтуу буфери менен жумушчу концентрацияга чейин суюлтуңуз.

5. TMB субстанциясы: эритменин керектүү дозасын стерилденген учтары менен соруңуз жана калдык эритмени кайрадан флаконго төкпөңүз.TMB субстанциясы жарыкка сезгич, TMB субстратына көп убакыт бою жарык тийбеңиз.

Протоколду колдонуу

1. Талдоо үчүн зарыл болгон тилкелердин санын аныктаңыз.Колдонуу үчүн рамкаларга тилкелерди салыңыз.Бул анализде колдонулбаган калган пластина тилкелери кургаткыч менен баштыкка кайра салынышы керек.Муздаткычта сактоо үчүн баштыкты бекем жабыңыз.

2. Тиешелүү скважиналарга стандарттык, бланктын жана үлгүлөрдүн эритмелеринин ар бирине 100 мкл кошуңуз.Пластина мөөр менен жаап коюңуз.Бөлмө температурасында 500 айн/мин ылдамдыкта чайкап 1 саат инкубациялоо.Үлгүлөр STE буфери менен так анализ үчүн тиешелүү концентрацияга чейин суюлтулушу керек.

3. Жуу кадамы: эритмени соруңуз жана ар бир скважинага 250 мкл жуу буфери менен жууп, 30 секундга туруштук бериңиз.Пластинканы соргуч кагазга чаптоо менен жуугуч буферди толугу менен жок кылыңыз.Толугу менен 4 жолу жуу.

4. Ар бир кудукка 100μL биотинилденген аныктоочу антитело жумушчу эритмесин кошуңуз.Пластина мөөр менен жаап коюңуз.Бөлмө температурасында 500 айн/мин ылдамдыкта чайкап 1 саат инкубациялоо.

5. Жуу кадамын кайталаңыз.

6. Ар бир кудукка 100μL HRP-стрептавидин жумушчу эритмесин кошуңуз.Пластина мөөр менен жаап коюңуз.Бөлмө температурасында 500 айн/мин ылдамдыкта чайкап 30 мүнөт инкубациялаңыз.

7. Жуу кадамын кайра кайталаңыз.

8. Ар бир кудукка 100μL TMB субстрат эритмесин кошуңуз.Пластина мөөр менен жаап коюңуз.RT жарыктан коргоо боюнча 30 мүнөт инкубациялоо.Суюктук субстрат эритмесин кошуу менен көк түскө айланат.

9. Ар бир скважинага 50мкл токтотуучу эритмени кошуңуз.Суюктук токтоо эритмесин кошуу менен сары түскө айланат.Андан кийин микропластинаны окугучту иштетиңиз жана дароо 450нм өлчөө жүргүзүңүз.

Жыйынтыктарды эсептөө

1. Ар бир стандарттын, контролдун жана үлгүлөрдүн кайталануучу көрсөткүчтөрүн орточо алып, орточо нөлдүк стандарттык оптикалык тыгыздыкты алып салыңыз.Вертикалдык (Y) огунда абсорбциясы жана горизонталдык (X） огу боюнча dsRNA концентрациясы бар стандарттуу ийри сызыкты түзүңүз.

2. Эсептөөлөрдү 5 же 4 параметрлик сызыктуу эмес ылайыктуу моделде ийри эксперт 1.3 же ELISA Calc сыяктуу компьютердик ийри сызыктарды орнотуучу программалык камсыздоо менен аткаруу сунушталат.

Performance

1. Сезимталдуулук:

аныктоонун төмөнкү чеги: ≤ 0.001pg/μL (UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA үчүн), ≤ 0.01pg/μL (5-OMe-UTP-dsRNA үчүн).

сандын төмөнкү чеги: 0,0156 пг/мкЛ (UTP-, pUTP-dsRNA үчүн), 0,0312 пг/мкЛ (N1-Me-pUTP-dsRNA үчүн), 0,0625 пг/мкЛ (5-OMe-UTP-dsRNA үчүн).

2. Тактык: Intra-Assay CV ≤10%, CV Inter-Assay ≤10%

3. Калыбына келтирүү: 80% ~ 120%

4.Сызыктуулугу: 0.0156-0.5pg/μL (forUTP-, pUTP-dsRNA) 0.0312-1pg/μL (forN1-Me-pUTP dsRNA), 0.0625-1pg/μL (5-OMe-UTP-dsRNA үчүн).

Карап чыгуулар

1. TMB реакция температурасы жана убактысы өтө маанилүү, сураныч, катуу көрсөтмөгө ылайык, аларды көзөмөлдөө.

2. Анализдин жакшы кайталанышына жана сезгичтигине жетишүү үчүн ашыкча реакцияга кирбеген реагенттерди алып салуу үчүн плиталарды туура жууш керек.

3. Бардык реагенттерди колдонуудан мурун кылдат аралаштыруу керек жана үлгү же реагенттерди кошууда бүдүрчөлөрдөн сактануу керек.

4. Эгерде концентрацияланган жуу буферинде кристаллдар пайда болсо (20x), 37℃ чейин жылытып, кристаллдар толугу менен эригиче акырын аралаштырыңыз.

5. Натрий азиди (NaN3) камтыган үлгүлөрдү анализдөөдөн качыңыз, анткени ал HRP активдүүлүгүн бузушу мүмкүн, натыйжада dsRNA көлөмү аз бааланат.

6. Анализ учурунда RNase булгануусунан качыңыз.

7. Стандарт/үлгү, детектордук антитело жана SA-HRP да РТда чайкабастан жүргүзүлүшү мүмкүн, бирок бул аныктоо сезгичтигинин бир эсеге төмөндөшүнө алып келиши мүмкүн.Бул учурда, биз UTP жана pUTP dsRNA стандарттарын 2pg/μL, N1-Me-pUTP dsRNA стандарттарын 4pg/μL жана 5-OMe-UTP dsRNA стандартын 8pg/μL чейин суюлтууну сунуштайбыз.Мындан тышкары, HRP-стрептавидин жумушчу эритмени бөлмө температурасында 60 мүнөт инкубациялаңыз.Колбаны чайкагычты колдонбоңуз, анткени колбага чайкоочу туура эмес натыйжага алып келиши мүмкүн.

Типтүү натыйжа

1. Стандарттык ийри маалыматтар

2. Стандарттык ийри сызыкты эсептөө

3. Лайнерди аныктоо диапазону: 0.0312- 1pg/μL