PNGase F
Пептид-N-гликозидаза F (PNGase F) - гликопротеиндердеги дээрлик бардык N-байланышкан олигосахариддерди жок кылуу үчүн эң эффективдүү ферменттик ыкма.PNGase F - бул амидаза, ал N-байланышкан гликопротеиндердеги жогорку манноза, гибрид жана татаал олигосахариддердин ички GlcNAc менен аспарагин калдыктарынын ортосунда бөлүнөт.
Колдонмо
Бул фермент протеиндердин карбонгидрат калдыктарын алып салуу үчүн пайдалуу.
Даярдоо жана спецификация
| Көрүнүш | Түссүз суюктук |
| Протеин тазалыгы | ≥95% (SDS-PAGEден) |
| Активдүүлүк | ≥500,000 U/мл |
| Экзогликозидаза | Эч кандай аракет табылган жок (ND) |
| Эндогликозидаза F1 | ND |
| Эндогликозидаза F2 | ND |
| Эндогликозидаза F3 | ND |
| Эндогликозидаза H | ND |
| Протеаза | ND |
Properties
| EC номери | 3.5.1.52(Микроорганизмден рекомбинант) |
| Молекулярдык салмак | 35 кДа (SDS-PAGE) |
| Изоэлектрдик чекит | 8. 14 |
| Оптималдуу рН | 7,0-8,0 |
| Оптималдуу температура | 65 °C |
| Субстраттын өзгөчөлүгү | GlcNAc менен аспарагин калдыктарынын ортосундагы гликозиддик байланыштарды ажыратуу Fig.1 |
| Таануу сайттары | Курамында α1-3 фукоза болбосо, N-байланышкан гликандар 2-сүрөт |
| Активаторлор | DTT |
| Ингибитор | SDS |
| Сактоо температурасы | -25 ~-15 ℃ |
| Жылуулук инактивациялоо | 1μL PNGase F камтыган 20μL реакция аралашмасы 75 °C температурада 10 мүнөт инкубациялоо аркылуу инактивацияланат. |
1-сүрөт PNGase F субстраттык өзгөчөлүгү
2-сүрөт PNGase F-ди таануу.
Ички GlcNAc калдыктары α1-3 фукоза менен байланышканда, PNGase F N-байланышкан олигосахариддерди гликопротеиндерден ажырата албайт.Бул модификация өсүмдүктөрдө жана кээ бир курт-кумурскалардын гликопротеиндеринде кеңири таралган.
Cкаршылаштары
|
| Компоненттер | Концентрация |
| 1 | PNGase F | 50 мкл |
| 2 | 10 × Гликопротеин денатурациялоочу буфер | 1000 мкл |
| 3 | 10×GlycoBuffer 2 | 1000 мкл |
| 4 | 10% NP-40 | 1000 мкл |
Бирдиктин аныктамасы
Бир бирдик(U) 10 мкл реакциянын жалпы көлөмүндө 37°Cде 1 сааттын ичинде 10 мкг денатуратталган RNase Bден >95% углеводду алып салуу үчүн зарыл болгон ферменттин көлөмү катары аныкталат.
Реакция шарттары
1. 1-20 мкг гликопротеинди деионизацияланган суу менен эритип, 1 мкл 10 × гликопротеинди денатуризациялоочу буферди жана H2O (зарыл болсо) 10 мкл жалпы реакция көлөмүн түзүңүз.
2.100°С температурада 10 мүнөт инкубациялоо, музда муздатуу.
3.2 мкл 10×GlycoBuffer 2, 2 мкл 10% NP-40 кошуп, аралаштырыңыз.
4.1-2 мкл PNGase F жана H кошуңуз2О (зарыл болсо) 20 мкл жалпы реакция көлөмүн түзүү жана аралаштыруу.
5.Реакцияны 37°C температурада 60 мүнөткө инкубациялоо.
6.SDS-PAGE талдоо же HPLC талдоо үчүн.
