Vaccinia вирусун каптоочу энзим

Vaccinia вирусун жабуу ферменти Vaccinia каптоочу ферменттин гендерин алып жүрүүчү рекомбинантты E. coli штаммынан алынган.Бул жалгыз фермент эки суббирдиктен (D1 жана D12) турат жана үч ферменттик активдүүлүккө ээ (РНК трифосфатаза жана D1 суббирдиги менен гуанилилтрансфераза жана D12 суббирдиги менен гуанин метилтрансфераза).Vaccinia вирусун каптоочу энзим капкак структурасынын пайда болушун катализдөө үчүн эффективдүү, ал атайын РНКнын 5′ учуна 7-метилгуанилат капкак түзүмүн (m7Gppp, Cap 0) тиркөө алат.Капкактын түзүлүшү (Cap 0) эукариоттордо мРНКны турукташтырууда, ташууда жана которууда маанилүү роль ойнойт.РНКны ферментативдик реакция менен жабуу – бул in vitro транскрипция, трансфекция жана микроинъекция үчүн РНКнын туруктуулугун жана котормосун олуттуу түрдө жакшыртуучу эффективдүү жана жөнөкөй ыкма.

Компоненттер

Vaccinia вирусун жабуу энзими (10 U/мкл)

10 × Каптоочу буфер

Сактоо шарттары

Сактоо үчүн -25～- 15℃ （ Кайталануучу тоңдуруу-эрүү циклдарынан качыңыз）

Сактоочу буфер

20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl,

1мМ ДТТ, 0.1мМ ЭДТА, 0.1% Тритон Х- 100, 50% глицерин.

Бирдиктин аныктамасы

Vaccinia вирусунун каптоочу энзиминин бир бирдиги 37°C температурада 1 сааттын ичинде 80нт транскриптине 10пмоль GTP кошуу үчүн зарыл болгон ферменттин көлөмү катары аныкталат.

Сапатты көзөмөлдөө

Экзонуклеаза:10U Vaccinia вирусунун каптоочу энзими 1μg λ-Hind III тайдырган ДНКны 37 ℃ температурада 16 саат бою агароз гел электрофорези менен аныкталгандай деградацияга алып келбейт.

Эндонуклеаза:Vaccinia вирусунун каптоочу ферментинин 10U 1μg λДНКсы бар 37℃ температурада 16 саат бою агароз гелинин электрофорези менен аныкталгандай эч кандай деградацияны бербейт.

Никаза:Vaccinia вирусунун каптоочу ферментинин 10U 1 мкг pBR322 менен 37 ℃ температурада 16 саат бою агароз гелинин электрофорези менен аныкталгандай деградация болбойт.

RNase:1,6 мкг MS2 РНКсы бар 10U Vaccinia вирусунун каптоочу ферменти 37℃ температурада 4 саат бою агароз гелинин электрофорези менен аныкталгандай деградацияны бербейт.

1.coli ДНКсы:Vaccinia вирусунун каптоочу энзиминин 10U E. coli геномдук ДНКсынын бар-жогуна E. coli 16S рРНК локусуна мүнөздүү праймерлер менен TaqMan qPCR аркылуу текшерилет.E. coli геномдук ДНК булганышы ≤1 E. coli геному болуп саналат.

2.Бактериялык Эндотоксин: LAL-тест, Кытай фармакопеясынын IV 2020 басылышына ылайык, гелдин чегин текшерүү ыкмасы, жалпы эреже (1143).Бактериялык эндотоксин мазмуну ≤10 ЕС/мг болушу керек.

Реакция системасы жана шарттары

1. Каптоо протоколу (реакциянын көлөмү: 20 мкл)

Бул процедура 10μg РНКны (≥100 nt) жабуу реакциясына тиешелүү жана аны эксперименттик талаптарга ылайык көбөйтүүгө болот.

I) 10мкг РНКны жана Нуклеазасыз H2Oну 1,5 мл микрофуга түтүкчөсүнө 15,0 мкл акыркы көлөмгө чейин бириктириңиз.*10×Capping Buffer: 0,5M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25℃, pH 8,0)

2) 65℃ температурада 5 мүнөт ысытыңыз, андан кийин 5 мүнөт муз ваннасы.

3) Төмөнкү компоненттерди көрсөтүлгөн тартипте кошуңуз

*10×Катуу буфери:0,5 М Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25℃, pH8.0)

4) 37°C температурада 30 мүнөт инкубациялаңыз, РНК азыр жабылып, ылдыйкы агымдагы колдонмолорго даяр.

2. 5′ терминал белгилөө реакциясы (реакция көлөмү: 20 мкл)

Бул протокол 5´ трифосфатты камтыган РНКны белгилөө үчүн иштелип чыккан жана ал талаптарга ылайык масштабдалат.Энбелгилерди киргизүүнүн натыйжалуулугуна РНКнын молярдык катышы таасир этет: GTP, ошондой эле РНК үлгүлөрүндөгү GTP мазмуну.

1) 1,5 мл микрофуга түтүкчөсүнө РНКнын жана нуклеазасыз H2Oнун тиешелүү көлөмүн 14,0 мкл акыркы көлөмгө чейин бириктириңиз.

2) 65℃ температурада 5 мүнөт ысытыңыз, андан кийин 5 мүнөт муз ваннасы.

3) Төмөнкү компоненттерди көрсөтүлгөн тартипте кошуңуз.

** GTP MIX GTP жана аз сандагы маркерлерди билдирет.GTP концентрациясы үчүн, карагылаЭскертүү 3.

4) 37°C температурада 30 мүнөт инкубациялаңыз, РНКнын 5′ учу эми этикеткаланган жана ылдый агымга даяр

Тиркемелер

1. Котормо анализдери/in vitro которуу алдында мРНКны жабуу

2. mRNAнын 5´ учун этикеткалоо

Колдонуу боюнча эскертүүлөр

1.Vaccinia Capping Enzyme менен инкубациялоонун алдында РНК эритмени ысытуу транскрипттин 5'учундагы экинчилик структураны жок кылат.Белгилүү жогорку структуралуу 5'учтары бар стенограммалар үчүн убакытты 60 мүнөткө чейин узартыңыз.

2. Реакцияларды жабуу үчүн колдонулган РНК колдонуудан мурун тазаланып, нуклеазасыз сууда суспензияланышы керек.ЭДТА болбошу керек жана эритмеде туздар жок болушу керек.

3. 5´ учун белгилөө үчүн жалпы GTP концентрациясы реакциядагы мРНКнын молярдык концентрациясынан 1-3 эсеге жакын болушу керек.

4. Реакция системасынын көлөмү иш жүзүндөгүгө жараша чоңойтулуп же кичирейтилиши мүмкүн.