M-MLV тескери транскриптаза
RevScript Reverse транскриптаза гендик инженерия технологиясы менен алынган.Ал жогорку cDNA синтездөө жөндөмдүүлүгүнө, жылуулук туруктуулугуна жана реакция температурасынын чегине (60°C чейин) ээ.Синтезделген cDNA продуктусу 10 кб чейин.Ал калыптардын жакындыгын жогорулатат жана татаал экинчилик структурасы же аз көчүрмө гендери бар РНК шаблондорунун тескери транскрипциясы үчүн ылайыктуу.
Компоненттер
| Компонент | HC2003B (10,000U) | HC2003B (5*10,000U) | HC2003B (200 000U) |
| RevScript тескери транскриптаза (200U/мкл) | 50 мкл | 5×50 мкл | 1 мл |
| 5 × RevScript буфери | 250 мкл | 1,25 мл | 5 мл |
Сактоо абалы
Бул продукт -25 ° C ~ -15 ° C 2 жыл сакталышы керек.
Бирдиктин аныктамасы
Бир бирдик 1 нмоль dTTPди кислотада эрибеген материалга 10 мүнөттүн ичинде 37°C Олиго(дТ) катары праймерлер катары киргизет.
Reaction Setup
1.РНК шаблонунун денатурациясы (Бул кадам милдеттүү эмес, РНК шаблонунун денатурациясы экинчилик структураларды ачууга жардам берет, бул кДНКнын биринчи тилкесинин түшүмүн жакшыртат.)
| Компоненттер | Көлөмү (мкл) |
| RNase акысыз ddH2O | 13кө |
| Олиго(дТ)18 (50 мкмоль/л) же Random Primer (50 мкмоль/л) Же генге тиешелүү праймерлер (2 мкмоль/л) | 1 |
| же 1 | |
| же 1 | |
| РНК шаблону | X a |
Эскертүүлөр:
1) а: Жалпы РНК: 1-5 мг же мРНК: 1-500 нг
2) 65°C температурада 5 мүнөт инкубациялоо, андан кийин музга дароо 2 мүнөт муздатуу.Реакция суюктугун чогултуу үчүн кыскача центрифугалоо, төмөнкү таблицада көрсөтүлгөндөй тескери транскрипция реакциясынын эритмесин кошуңуз.Акырын пипетка менен аралаштырыңыз.
1.Реакция аралашмасын даярдоо (20 мкл көлөмү)
| Компоненттер | Көлөмү (мкл) |
| Мурунку кадамдын аралашмасы | 13 |
| 5×Буфер | 4 |
| dNTP аралашмасы (10нмоль/л) | 1 |
| Кайтарым транскриптаза (200 U/мкл) | 1 |
| RNase ингибитору (40 U/мкл) | 1 |
1.Реакцияны төмөнкү шарттарда аткарыңыз:
| Температура (°C) | Убакыт |
| 25 °Ca | 5мин |
| 42 °Cb | 15-30мин |
| 85 °Cc | 5мин |
Эскертүүлөр:
1) а.25°C температурада 5 мүнөт инкубациялоо кокус гексамерлерди колдонуу үчүн гана талап кылынат.Сураныч, Oligo (dT) колдонуп жатканда бул кадамды өткөрүп жибериңиз18же генге атайын праймер.
2) б.Сунушталган тескери транскрипция температурасы 42°C. Татаал экинчилик структурасы же жогорку GC мазмуну бар шаблондор үчүн реакциянын температурасын 50-55°Сге чейин көтөрүү сунушталат.
3) в.Тескери транскриптазаны инактивациялоо үчүн 85°С 5 мүнөт ысытуу.
4) Продукт түздөн-түз ПТР же qPCR реакцияларында колдонулушу мүмкүн, же кыска мөөнөттүү сактоо үчүн -20°Cде сакталат.Продукцияларды бөлүү жана узак мөөнөткө сактоо үчүн -80°С температурада сактоо сунушталат.Тез-тез тоңуп-эрүүдөн качыңыз.
5) продукт бир кадам RT-qPCR үчүн ылайыктуу болуп саналат, ал ар бир 25μL реакция системасы үчүн 10-20 U тескери транскриптаза кошуу сунуш кылынат, же бара-бара реалдуу кырдаалга ылайык тескери транскриптаза көлөмүн көбөйтүү.
Эскертүүлөр
1.Сураныч, эксперименталдык аянтты таза кармаңыз;Иш учурунда таза кол кап жана беткап кийүү керек.Экспериментте колдонулган бардык чыгымдалуучу материалдар RNase булганышын алдын алуу үчүн RNase бош болушу керек.
2.РНКнын бузулушуна жол бербөө үчүн бардык процедуралар музда жүргүзүлүшү керек.
3.Жогорку сапаттагы РНК үлгүлөрү тескери транскрипциянын жогорку натыйжалуулугун камсыз кылуу үчүн сунушталат.
4.Бул продукт изилдөө үчүн гана колдонулат.
5.Сураныч, коопсуздугуңуз үчүн лабораториялык халат жана бир жолу колдонулуучу кол каптар менен иштеңиз.
