5×Neoscript Fast RT-qPCR Premix плюс-UNG
Cat №: HCB5142A
Neoscript Fast RT Premix-UNG (Probe qRT-PCR) - бул бир кадамдуу тескери транскрипция жана сандык ПТР (qRT-PCR) үчүн ылайыктуу, бир түтүктүү зонд негизиндеги өтө туруктуу аралашма.Бул праймерлерди жана зонддорду алдын ала аралаштырууну колдойт жана төмөн температурада узак убакыт сакталгандан кийин туруктуу бойдон калат.Сыналуучу үлгүнү колдонууда, кошумча түтүктү ачуу/тамшуру операциясысыз эле кошууга болот.Бул продукт компоненттерди камсыз кылат, мисалы, ысык башталгыч ДНК полимераза, M-MLV, ысыкка чыдамдуу урацил ДНК гликозилаза (TS-UNG), RNase ингибитору, MgCl2, dNTPs (dTTP ордуна dUTP менен) жана стабилизаторлор.Генетикалык жактан өзгөртүлгөн тез күчөтүлгөн тескери транскриптаза жана ДНК полимераза менен ПЦР күчөтүүнү 20-40 мүнөттүн ичинде бүтүрүүгө болот.Бул реагент qPCR үчүн атайын буферди антиингибитордук күчөтүү ферментинин жана UNG ферментинин аралаш ферменттери менен колдонот.Ошондуктан, ал максаттуу гендердин жакшы күчөтүү алуу жана ПЦР калдыктары жана аэрозоль булганышы менен шартталган жалган күчөтүү алдын алат.Бул реагент Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad жана Roche сыяктуу өндүрүүчүлөрдүн флуоресценттик сандык ПТР аспаптарынын көбү менен шайкеш келет.
Компонент
1.25×Neoscript Fast RTase/UNG Mix
2.5×Neoscript Fast RT Premix буфери (dUTP)
Сактоо шарттары
Бардык компоненттер узак мөөнөттүү сактоо үчүн -20 ℃ жана 4 ℃ 3 айга чейин сакталышы керек.Эриткенден кийин жакшылап аралаштырыңыз жана колдонуудан мурун центрифугалаңыз.Тез-тез тоңуп-эрүүдөн качыңыз.
qRT-PCR реакция системасын даярдоо
| Компоненттер | 25мклСистема | 50мклСистема | Акыркы концентрация |
| 5×Neoscript Fast RT Premix буфери (dUTP) | 5μL | 10μL | 1× |
| 25×Neoscript Fast RTase/UNG Mix | 1μL | 2мкл | 1× |
| 25×Праймер-Зонд аралашмасыa | 1μL | 2мкл | 1× |
| Үлгү РНКb | – | – | – |
| ddH2O | 25 мкл чейин | 50 мкл чейин | – |
1) а.Праймердин акыркы концентрациясы, адатта, 0,2μM.Жакшыраак натыйжалар үчүн, праймердин концентрациясын 0,2-1μM чегинде оптималдаштырса болот.Жалпысынан, зонд концентрациясын 0.1-0.3μM чегинде оптималдаштырса болот.
2) b. Тез ПТР процедурасын колдонууда, праймерлердин жана зонддордун концентрациясын жогорулатуу күчөтүү натыйжаларын жакшыртышы мүмкүн жана алардын катышы ошого жараша оптималдаштырылышы керек.
3) Үлгүлөрдүн ар кандай түрлөрү ингибиторлордун ар кандай түрлөрүн жана мазмунун жана максаттуу гендин копия санын камтыйт.Үлгү көлөмү чыныгы шарт менен каралышы керек.Зарыл болсо, үлгүнү нуклеазасыз суу же TE буфери менен суюлтуңуз.
Реакция Cшарттар
| Кадимки ПЦР процедурасы | Тез ПЦР процедурасы | ||||||
| Процедура | Темп. | Убакыт | Цикл | Процедура | Темп. | Убакыт | Цикл |
| Тескери транскрипция | 50℃ | 10-20мин | 1 | Тескери транскрипция | 50℃ | 5мин | 1 |
| Полимераз Активдештирүү | 95℃ | 1-5мин | 1 | Полимераз Активдештирүү | 95℃ | 30s | 1 |
| Денатурация | 95℃ | 10-20с | 40-50 | Денатурация | 95℃ | 1-3сек | 40-50 |
| Жылуулоо жана Кеңейтүү | 56-64℃ | 20-60с | Жылуулоо жана Кеңейтүү | 56-64℃ | 3-20с | ||
Сапатты көзөмөлдөө
1.Функцияны аныктоо: qPCRдин сезгичтиги, өзгөчөлүгү жана кайталануучулугу.
2.Экзогендик нуклеаздык активдүүлүк жок: экзогендик эндонуклеаза жана экзонуклеаза булганбайт.
Эскертүүлөр
1.Ыкчам ДНК полимеразанын күчөшүнүн ылдамдыгы 1кб/10с кем эмес.Ар кандай ПТР аспаптарында ар кандай жылытуу жана муздатуу ылдамдыгы, температураны көзөмөлдөө режимдери жана жылуулук өткөрүмдүүлүк бар, ошондуктан сиздин праймериңиздин/зондуңуздун концентрациясын жана иштөө ыкмасын оптималдаштыруу сиздин спецификалык тез ПТР аспабыңыз менен айкалышта өтө маанилүү.
2.Бул продукт кеңири колдонууга жөндөмдүү жана ал жогорку сезгичтүү молекулярдык диагностика үчүн ылайыктуу.Үч баскычтуу ПТР ыкмасы күйгүзүү температурасы төмөн праймерлер үчүн же 200 bp жогору узун фрагменттерди күчөтүү үчүн сунушталат.
3.Ар түрдүү ампликондор dUTP ар кандай колдонуу эффективдүүлүгүнө жана UNGге карата ар кандай сезгичтикке ээ болгондуктан, UNG системасын колдонууда аныктоо сезгичтиги азайса, реагенттерди оптималдаштыруу керек.Керек болсо техникалык колдоо үчүн биз менен байланышыңыз.
4.Өткөрүлгөн ПТР продуктуларынын күчөшүнө жол бербөө үчүн күчөтүү үчүн атайын эксперименталдык аянт жана пипетка керек.Колкап менен операция жасаңыз жана тез-тез алмаштырыңыз жана күчөгөндөн кийин ПТР түтүгүн ачпаңыз.
