RTL тескери транскриптаза
RTL тескери транскриптазасы 3'→5' экзонуклеаза активдүүлүгү жок жана RNase H активдүүлүгүнө ээ болгон РНК шаблонуна көз каранды ДНК полимераза.Бул энзим РНКны ДНКнын комплементарлык тилкесин синтездөө үчүн шаблон катары колдоно алат, ал биринчи катардагы cDNA синтезине, өзгөчө RT-LAMP үчүн (циклдик изотермикалык күчөтүү) колдонулушу мүмкүн.RTL тескери транскриптаза 1.0 менен салыштырганда, сезгичтик бир кыйла жакшырды, жылуулук туруктуулугу күчтүүрөөк жана 65 ° C реакциясы туруктуураак.RTL тескери транскриптазасы (глицеринсиз) лиофилизацияланган препараттарды, лиофилизацияланган RT-LAMP реагенттерин ж.б. даярдоо үчүн колдонулушу мүмкүн.
Бирдиктин аныктамасы
Бир блок поли(A)•oligo(dT)25ти шаблон-праймер катары колдонуу менен 50°C температурада 20 мүнөттө кислота-чөкмө материалга 1 нмоль dTTP кошот.
Компоненттер
| Компонент | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL тескери транскриптаза (глицеринсиз) (15U/мкл) | 0,1 мл | 1 мл | 10 мл |
| 10×HC RTL буфери | 1,5 мл | 4×1,5 мл | 5×10 мл |
| MgSO4 (100мМ) | 1,5 мл | 2×1,5 мл | 3×10 мл |
Сактоо абалы
0 ° C астында ташуу жана -25 ° C ~ -15 ° C сакталат.
Сапатты көзөмөлдөө
- калдык активдүүлүгүEдонуклеаза:1 мкг λДНК жана 15 бирдик RTL2.0 камтыган 50 мкл реакция 37 ℃ температурада 16 саатка инкубацияланган гель электрофорези аркылуу терс контролдоо сыяктуу эле көрүнүштү көрсөтөт.
- калдык активдүүлүгүЭкзонуклеаза:1 мкг Hind Ⅲ сиңирилген λДНК жана 15 бирдик RTL2.0 камтыган 50 мкл реакция 37 ℃ температурада 16 саатка инкубацияланган гель электрофорези менен терс башкаруу сыяктуу эле үлгүнү көрсөтөт.
- калдык активдүүлүгүNickase:37°C температурада 4 саатка инкубацияланган 1 мкг суперкирленген pBR322 жана 15 бирдик RTL2.0 камтыган 50 мкл реакция гель электрофорези аркылуу терс башкарууну көрсөтөт.
- калдык активдүүлүгүRNase:0,48 мкг MS2 РНК жана 15 бирдик RTL2,0 камтыган 10 мкл реакция 37°Cде 4 саатка инкубацияланган гель электрофорези менен терс башкаруудагыдай эле көрүнүштү көрсөтөт.
- E. coli gДНК:менен өлчөнөтE.coliконкреттүү HCD аныктоо топтомдору， 15 RTL2.0 бирдиги 1ден азды камтыйтE. coliгеном.
Reaction Setup
cDNA синтези протоколу
| Компоненттер | Көлөм |
| Калып РНК a | кошумча |
| Oligo(dT) 18~25(50uM) же Random Primer аралашмасы (60uM) | 2 мкл |
| dNTP Mix (ар бири 10мМ) | 1 мкл |
| RNase ингибитору (40U/uL) | 0,5 мкл |
| RTL Reverse Transscriptase 2.0 (15U/uL) | 0,5 мкл |
| 10×HC RTL буфери | 2 мкл |
| Нуклеазсыз суу | 20 мкл чейин |
Эскертүүлөр:
1) Жалпы РНКнын сунушталган дозасы 1ng~1μg
2) мРНКнын сунушталган дозасы 50нг~100нг болгон
Термо-велосипед тебүү Күнүмдүк иштөө үчүн шарттар реакция:
| Температура (°C) | Убакыт |
| 25 °Ca | 5мин |
| 55 °C | 10минb |
| 80 °C | 10мин |
Эскертүүлөр:
1) Эгерде Random Primer Mix колдонулса, 25°C температурада инкубациялоо кадамы.
2) Эгерде максаттуу праймер аралашмасы колдонулса, 55°C 10~30 мүнөт инкубациялоо кадамы.
RT-LAMP протоколу
| Компоненттер | Көлөм | Акыркы концентрация |
| Үлгү РНК | кошумча | ≥10 нуска |
| dNTP Микс (10мМ) | 3,5 мкл | 1,4 мм |
| FIP/BIP праймерлери (25×) | 1 мкл | 1,6 мкм |
| F3/B3 праймерлер (25×) | 1 мкл | 0,2 мкм |
| LoopF/LoopB Primers (25×) | 1 мкл | 0,4 мкм |
| RNase ингибитору (40U/мкл) | 0,5 мкл | 20 U/Reaction |
| RTL тескери транскриптаза 2.0 (15U/мкл) | 0,5 мкл | 7.5 U/Reaction |
| Bst V2 ДНК Полимераза (8U/мкл) | 1 мкл | 8 U/Reaction |
| MgSO4 (100мМ) | 1,5 мкл | 6 мм (жалпы 8 мм) |
| 10×HC RTL буфери (же 10×HC Bst V2 буфери) | 2,5 мкл | 1 × (2мМ Mg2+) |
| Нуклеазсыз суу | 25 мкл чейин | - |
Эскертүүлөр:
1) Вортекс менен аралаштырыңыз жана чогултуу үчүн кыска убакытка центрифугалаңыз.65°С температурада 1 саатка туруктуу инкубациялоо.
2) Эки буфер бири-бирине шайкеш келет жана бирдей составга ээ.
Эскертүүлөр
1.This продукт -20 °C сакталган ак катуу пайда болот.Аны -20°Сден алып чыгып, 10 мүнөттөй музга коюңуз.Эриткенден кийин чайкап, аралаштырып колдонсо болот.
2.КДНК продуктуну -20°C же -80°C температурасында сактоого же ПЦР реакциясы үчүн дароо колдонсо болот.
3. RNase булганышын алдын алуу үчүн, эксперименталдык аймакты таза кармаңыз жана операция учурунда таза колкап жана беткап кийиңиз.
