EndoFree Plasmid Maxi комплект
Бул комплект түн ичинде өстүрүлгөн 150 – 300 мл бактерия эритмесинен, жакшыртылган SDS-щелочтук лизис ыкмасын колдонуп, бактерияларды лизис үчүн жарактуу.Чийки экстракт уникалдуу эндотоксинди тазалоочу менен тандалып бириктирилет жана эндотоксиндерди жок кылуу үчүн центрифугалоо жолу менен бөлүнөт.Андан кийин, силикагель мембранасы жогорку туз жана төмөнкү рН шарттарында эритмедеги плазмиддик ДНК менен тандалма байланышта.Андан кийин кирлерди жана башка бактериялык компоненттерди жок кылуу үчүн жуу буфери кошулат.Акыр-аягы, аз туздуу, жогорку рН элюциялык буфер кремний матрицалык мембранасынан таза плазмиддик ДНКны элюциялоо үчүн колдонулат.Силикагель кабыкчасы атайын адсорбциялык мембрананы колдонот жана мамыча менен мамычанын ортосундагы адсорбция суммасынын айырмасы абдан аз жана кайталануу жакшы.Фенол, хлороформ жана башка уулуу реагенттер талап кылынбайт, ошондой эле этанолду чөктүрүүнүн кадамдары талап кылынбайт.Бул комплект 80% -90% экстракция ылдамдыгы менен 0,2 -1,5 мг таза жогорку көчүрмөлүү плазмиддик ДНКны тез бөлүп алуу үчүн колдонулушу мүмкүн.Комплект эндотоксинди жок кылуучу уникалдуу процесс формуласын колдонот, эндотоксиндин мазмуну өтө төмөн жана клетканы трансфекциялоо эффектиси эң сонун.Алынган плазмид түздөн-түз ферменттерди сиңирүү, ПТР, in vitro транскрипция, трансформация, секвенирлөө жана башка молекулярдык биология эксперименттеринде колдонулушу мүмкүн.
Сактоо шарттары
RNaseA -30 ~ -15 ℃ сакталышы жана ≤0 ℃ ташуу керек.
Endotoxin Scavenger бир ай бою 2 ~ 8 ℃ температурада сакталат, узак мөөнөттүү сактоо үчүн -30 ~ -15 ℃ сакталатжана ≤0℃та ташылат.
Башка компоненттер бөлмө температурасында (15 ~ 25 ℃) сакталышы жана бөлмө температурасында ташылышы керек.
Компоненттер
| Компоненттер | 10RXNS |
| RNase A | 750 мкл |
| P1 буфери | 75 мл |
| P2 буфери | 75 мл |
| P4 буфери | 75 мл |
| Эндотоксиндерди тазалоочу | 25 мл |
| Буфер PW | 2 × 22 мл |
| Буфердик кургак учук | 20 мл |
| FastPure ДНК Макси мамычалары (ар бири 50 мл коллекциялык түтүктө) | 10 |
| Эндотоксинсиз чогултуу түтүгү | 2 × 5 |
RNaseA:10 мг/мл, РНКны алып салуу үчүн колдонулат.
P1 буфери:бактериялык суспензия буфери, биринчи колдонуудан мурун буфер P1ге RNaseA кошуңуз.
P2 буфери:бактериялык лизис буфери (SDS/NaOH камтыган).
P4 буфери:нейтралдаштыруучу буфер.
Эндотоксиндерди тазалоочу:натыйжалуу чийки плазмид экстракты эндотоксин алып салуу.
буфер PW:буферди жууп, биринчи колдонуудан мурун этанолдун белгиленген көлөмүн кошуңуз.
Буфердик кургак учук:элюциялык буфер.
FastPure ДНК Макси Мамычалары:плазмиддик ДНК адсорбция мамычалары.
Коллекциялык түтүктөр 50 мл:чыпкалоочу түтүктөр.
Эндотоксинсиз чогултуучу түтүк:плазмиддик ДНК чогултуу түтүктөр.
Даярдалган материалдар
Абсолюттук этанол, изопропанол, 50 мл тегерек түбү бар центрифугалык түтүктөр жана 50 мл эндотоксинсизцентрифугалык түтүктөр.
Тиркемелер
Бул продукт 150 - 300 мл бактериялык эритмеден плазмиддерди ири өлчөмдө алуу үчүн ылайыктуутүн ичинде маданияттуу.
Эксперимент процесси
1. Түн ичинде өстүрүлгөн 150 – 200 мл (300 млден көп эмес) бактериялык эритмени алып, центрифугалооболжол менен 11 000 айн/мин (12 000 × г) 1 – 2 мүн.Супернатантты ыргытып, бактерияларды чогултуу.
Δ 50 млден ашык бактериалдык эритмени чогултууда бактерияларды ошол эле 50 мл түтүккө бактериялык эритмени кошуу, центрифугалоо, үстүнкү затты ыргытуу жана башка кадамдар менен чогултууга болот.
бир нече жолу.
2. Центрифугага 7,5 мл буфер P1 кошуңуз (RNaseA буферине P1 кошулганын текшериңиз)бактерияларды камтыган түтүккө салып, куюн же пипетинг аркылуу кылдат аралаштырыңыз.
Δ Бул этапта бактериялардын толук кайра суспензиясы түшүм алуу үчүн абдан маанилүү жана кайра суспензиядан кийин эч кандай бактериялык топтор болбошу керек.Эгер кылдат аралаштырылбаган бактериялык топтор бар болсо, ал лизиске таасирин тийгизет, натыйжада түшүмдүүлүк жана тазалык төмөн болот.Эгерде бактериалдык эритменин OD600 0,65 болсо, 150 мл бактерия эритмесинен экстракциялоодо 7,5 мл буфер Р1 колдонуу сунушталат;OD600 0,75 болгондо, 8 мл буфер P1 колдонулушу керек жана P2 жана P4 буферлеринин көлөмү тиешелүү түрдө өзгөртүлүшү керек.Эгерде бактериялык эритменин көлөмү 200 млге чейин көбөйтүлсө, анда аны колдонуу сунушталатP1, P2 жана P4 буферлеринин көлөмү пропорционалдуу түрдө көбөйтүлүшү керек.
3. 2-кадамдагы бактериялык суспензияга 7,5 мл P2 буферин кошуп, акырын 6 – 8 чейин өйдө-ылдый аралаштырыңыз.жолу жана бөлмө температурасында 4-5 мүнөт инкубациялоо.
Δ кылдат аралаштыруу үчүн акырын тескери буруңуз.Vortexing геномдук ДНК фрагменттелишине алып келет, натыйжада алынган плазмидада геномдук ДНК фрагменттери пайда болот.Бул учурда, эритме илешкек жана тунук болуп, бактериялар толугу менен лизиске өткөнүн көрсөтөт.Узактыгы плазмиддердин бузулушун болтурбоо үчүн 5 мүнөттөн ашпоого тийиш.Эгерде чечим ачык-айкын болбосо, анда бактериялар өтө көп болушу мүмкүнтолук эмес лизис, ошондуктан бактериялардын санын тиешелүү түрдө азайтуу керек.
4. 3-кадамдагы бактериялык суспензияга 7,5 мл P4 буферин кошуп, эритме P2 буферин толугу менен нейтралдаштырышы үчүн акырын 6 – 8 жолу тескери буруңуз.Бул учурда, ак флокуленттүү чөкмө пайда болушу керек.Болжол менен 11 000 айн/мин (12 000 × г) 10 – 15 мүнөткө центрифугалаңыз, үстүнкү затты жаңы 50 мл тегерек түбү центрифугалык түтүккө (өзүнчө даярдалган) кылдат пипетка менен сүртүңүз жанасүзүүчү ак чөктүрүүнү соруп алыңыз.
Δ P4 буферин кошуп, жакшылап аралаштыруу үчүн дароо буруңуз.Нейтралдаштырууга таасир эте турган жергиликтүү жаан-чачындын пайда болушуна жол бербөө үчүн, ак чөкмө эритмеге бирдей тараганга чейин түтүктү калтырыңыз.Эгерде центрифугалоого чейин бирдиктүү ак флокуленттүү чөкмө жок болсо жана центрифугадан кийин үстүнкү зат ачык болбосо, түтүктүдагы 5 мүнөт центрифугада.
5. 4-кадамдагы үстүнкү катмарга 0. 1 эсе көлөмдө (10% ашыкча көлөмдө, болжол менен 2,2 мл) Эндотоксин тазалоочу затты кошуп аралаштырыңыз.Эритмени муз ваннасына салыңыз же майдаланган музга (же муздаткычтын тоңдургучка) 5 мүнөткө эритме булгангандан тунук жана тунук болуп өзгөргөнчө (же дагы эле) салыңыз.бир аз булганган), кээде бир нече жолу аралаштырат.
Δ Эндотоксинди тазалоочу суюктукка кошулгандан кийин, үстүнкү зат булганып калат, бироксуюктук муз ваннасында муздагандан кийин тунук (же бир аз булганып) болушу керек.
6. Үстүңкү зат бөлмө температурасында (>25℃) 10 – 15 мүнөткө коюлгандан кийин, ал булганып калат.анын температурасы бөлмө температурасына чейин жогорулайт.Андан кийин супернатантты аралаштыруу үчүн айлантуу керек.
Δ Бөлмөнүн температурасы төмөн болсо же экстракция убактысын кыскартууну кааласаңыз, үстүнкү затты 37 ~ 42 ℃ суу мончосунда 5 – 10 мүнөткө инкубациялоого болот жана кийинки кадам супернатанттан кийин жүргүзүлүшү мүмкүн.булганып калат.
7. Фазаны бөлүп алуу үчүн үстүнкү затты 11 000 айн/мин (12 000 × г) 10 мүнөт бөлмө температурасында центрифугалаңыз (температура >25℃ болушу керек).Жогорку суулуу фазада ДНК бар, ал эми төмөнкү көк майлуу фазада эндотоксин жана башка аралашмалар бар.өткөрүп берүүДНК камтыган суу фазасы жаңы түтүккө жанамайлуу катмарын жок кылуу.
Δ Центрифугалоо учурундагы температура 25℃ жогору болушу керек, анткени эффективдүү фаза бөлүнбөйттемпература өтө төмөн болсо пайда болот.
Δ Эгерде фазаны бөлүү эффективдүү болбосо, центрифугалоо температурасын 30℃ жанацентрифугалоо убактысын 15 мүнөткө чейин көбөйтүүгө болот.
Δ Көк майлуу катмарды соруп албаңыз, анткени анда эндотоксин жана башка аралашмалар бар.
Механизм
Resuspension Lysis Neutralization
◇ 7,5 мл буфер P1 кошуңуз
◇ 7,5 мл буфер P2 кошуңуз
◇ 7,5 мл буфер P4 кошуңуз
Эндотоксинди алып салуу
◇Endotoxin Scavenger'дин үстүнкү көлөмүнөн 0. 1 эсе көп кошуңуз
Байлоо жана жуу
◇ 0,5 эсе көп изопропанолду кошуңуз
◇ 10 мл буфер PW кошуңуз
◇ 10 мл буфер PW кошуңуз
Элюция
◇ 1 – 2 мл буфер ТБ же эндотоксинсиз ddH2O кошуңуз
