M-MLV Neoscript Reverse Transscriptase
Neoscript Reverse Transscriptase - Moloney чычкан лейкозунун вирусунун M-MLV генинин мутация скринингинен жана E.coliде экспрессиядан алынган тескери транскриптаза.Фермент RNase H активдүүлүгүн жок кылат, жогорку температурага толеранттуулукка ээ жана жогорку температурадагы тескери транскрипцияга ылайыктуу.Демек, бул РНКнын жогорку деңгээлдеги структурасынын жана кДНКнын синтезине спецификалык эмес факторлордун жагымсыз таасирин жок кылуу үчүн пайдалуу жана жогорку туруктуулукка жана тескери транскрипция синтезине ээ.Фермент жогорку туруктуулукка жана тескери транскрипция синтезине ээ.
Компоненттер
1.200 U/μL Neoscript Reverse Transscriptase
2.5 × Биринчи катар буфери (милдеттүү эмес)
* 5 × First-Strand Buffer dNTP камтыбайт, реакция системасын даярдоодо dNTP кошуңуз
Сунушталган Колдонмо
1.Бир кадам qRT-PCR.
2.РНК вирусун аныктоо.
Сактоо абалы
Узак мөөнөттүү сактоо үчүн -20°C, колдонуудан мурун жакшылап аралаштыруу керек, тез-тез тоңуп-эрүүдөн сактануу керек.
Бирдиктин аныктамасы
Бир бирдик поли(A)•oligo(dT) менен 37°Cде 10 мүнөттө 1 нмоль dTTP камтыйт.25шаблон/праймер катары.
Сапатты көзөмөлдөө
1.SDS-PAGE электрофоретикалык тазалыгы 98% дан жогору.
2.Күчөтүү сезгичтиги, партиядан партияга башкаруу, туруктуулук.
3.Экзогендик нуклеаздык активдүүлүк, экзогендик эндонуклеаза же экзонуклеаза булгануусу жок
Биринчи чынжыр реакциясынын чечими үчүн реакцияны орнотуу
1.Реакция аралашмасын даярдоо
| Компоненттер | Көлөм |
| Олиго(дТ)12-18 Primer же Random Primerа Же генге атайын праймерлерb | 50 pmol |
| 50 pmol (20-100 pmol) | |
| 2 pmol | |
| 10 мМ dNTP | 1 мкл |
| Үлгү РНК | Жалпы РНК≤ 5μг;мРНК≤ 1 мкг |
| RNase-эркин dH2O | 10 мкл чейин |
Эскертүүлөр:a/b: Сынамык муктаждыктарыңызга жараша праймерлердин ар кандай түрлөрүн тандаңыз.
2.65°C температурада 5 мүнөт ысытыңыз жана музда 2 мүнөткө тез муздаңыз.
3.Жогорудагы системага төмөнкү компоненттерди 20μL жалпы көлөмүнө кошуп, акырын аралаштырыңыз:
| Компоненттер | Көлөмү (мкл) |
| 5 × Биринчи катар буфер | 4 |
| Neoscript Reverse Transscriptase (200 U/мкл) | 1 |
| RNase ингибитору (40 U/мкл) | 1 |
| RNase-эркин dH2O | 20 мкл чейин |
4. Сураныч, реакцияны төмөнкү шарттарга ылайык аткарыңыз:
(1) Эгерде Random Primer колдонулса, реакция 25 ℃ температурада 10 мүнөт, андан кийин 50 ℃ температурада 30 ~ 60 мүнөттө жүргүзүлүшү керек;
(2) Эгерде Oligo dT же атайын праймерлер колдонулса, реакция 50℃ температурада 30~60 мүнөттө жүргүзүлүшү керек.
5.Neoscript тескери транскриптазаны инактивациялоо жана реакцияны токтотуу үчүн 95℃ температурада 5 мүнөт ысытыңыз.
6.Тескери транскрипция продуктулары түздөн-түз ПТР реакциясында жана флуоресценттик сандык ПТР реакциясында колдонулушу мүмкүн же -20℃ узак убакытка сакталат.
ПЦР Раракет:
1.Реакция аралашмасын даярдоо
| Компоненттер | Концентрация |
| 10 × ПТР буфери (dNTP акысыз, Mg²+ бекер) | 1× |
| dNTPs (ар бир dNTP 10мМ) | 200 мкм |
| 25 мМ MgCl2 | 1-4 мм |
| Так ДНК Полимераза (5U/мкл) | 2-2,5 U |
| Primer 1 (10 мкм) | 0,2-1 мкм |
| Primer 2 (10 мкм) | 0,2-1 мкм |
| Шаблона | ≤10% Биринчи чынжыр реакциясынын эритмеси (2 мкл) |
| ddH2O | 50 мкл чейин |
Эскертүүлөр:a: Эгерде өтө көп биринчи чынжыр реакция эритмеси кошулса, ПТР реакциясы бөгөттөлүшү мүмкүн.
2.ПЦР реакциясынын процедурасы
| Кадам | Температура | Убакыт | Циклдер |
| Алдын ала денатурация | 95℃ | 2-5 мүнөт | 1 |
| Денатурация | 95℃ | 10-20 сек | 30-40 |
| Жылуулоо | 50-60℃ | 10-30 сек | |
| Кеңейтүү | 72℃ | 10-60 сек |
Эскертүүлөр
1.42 ℃ ~ 55 ℃ диапазондо тескери транскрипция температурасын оптималдаштыруу үчүн ылайыктуу.
2.Бул жакшыраак туруктуулукка ээ, жогорку температурадагы тескери транскрипцияны күчөтүү үчүн ылайыктуу.Мындан тышкары, ал РНКнын татаал структуралык аймактарынан эффективдүү өтүү үчүн ыңгайлуу.Ошондой эле, албир кадамдуу мультиплекс флуоресценттик сандык RT-PCR аныктоо үчүн ылайыктуу.
3.Ар кандай ПТР күчөтүү ферменттери менен жакшы шайкештик жана жогорку сезгичтик RT-PCR реакциялары үчүн ылайыктуу.
4.Жогорку сезгичтүү бир кадам флуоресценттик сандык RT-PCR реакциясы үчүн ылайыктуу, калыптардын аз концентрациясын аныктоо ылдамдыгын натыйжалуу жакшыртуу.
5.cDNA китепкана куруу үчүн ылайыктуу.
