Rnase ингибитору
Murine RNase ингибитору - E.coliден экспрессияланган жана тазаланган рекомбинантты чычкан RNase ингибитору.Ал RNase A, B же C менен 1:1 катышында коваленттүү эмес байланыш аркылуу байланышат, ошону менен үч ферменттин активдүүлүгүн токтотот жана РНКны бузулуудан коргойт.Бирок, бул RNase 1, RNase T1, S1 Nuclease, RNase H же Aspergillus RNase каршы натыйжалуу эмес.Murine RNase ингибитору RT-PCR, RT-qPCR жана IVT mRNA тарабынан сыналган жана ар кандай коммерциялык Reverse transscriptases, ДНК полимеразалары жана РНК полимеразалары менен шайкеш келген.
Адамдын RNase ингибиторлору менен салыштырганда, чычкан RNase ингибиторунда ингибитордун инактивацияланышын шарттаган кычкылданууга өтө сезгич эки цистеин жок.Бул DTT төмөн концентрациясында (1 мМден аз) аны туруктуу кылат.Бул өзгөчөлүк аны DTT жогорку концентрациялары реакцияга тескери болгон реакцияларда колдонууга ылайыктуу кылат (мисалы, реалдуу убакыттагы RT-PCR).
Aколдонмо
Бул продукт РНКнын деградациясын болтурбоо үчүн RNase кийлигишүүсү мүмкүн болгон ар кандай экспериментте кеңири колдонулушу мүмкүн, мисалы:
1.кДНКнын биринчи тилкесинин синтези, RT-PCR, RT-qPCR ж.б.
2.РНКны in vitro транскрипция/которуу учурунда бузулуудан коргойт (мисалы, in vitro вирустук репликация системасы).
3.РНКны бөлүү жана тазалоо учурунда RNase активдүүлүгүнө бөгөт коюу.
Сактоо шарттары
Продукцияны -25～-15 ℃ температурада сактоого болот, 2 жыл жарактуу.
Сактоочу буфер
50 mM KCl, 20 mM HEPES-KOH (pH 7,6, 25 ℃), 8 mM DTT жана 50% глицерин.
Бирдиктин аныктамасы
RNase ингибиторунун 5 нг рибонуклеаза А активдүүлүгүн 50% га токтотуу үчүн зарыл болгон сумма бир бирдик (U) катары аныкталган.
Белоктун молекулалык салмагы
Сычкан RNase ингибиторунун молекулалык салмагы 50 кДа.
Сапатты контролдоо
Экзонуклеаза Иш-аракет:
1 мкг λ -Hind III дайджест ДНКсы менен 40 U чычкан RNase ингибитору 37 ℃ температурада 16 саат бою агароз гел электрофорези менен аныкталгандай эч кандай деградацияны бербейт.
Эндонуклеазанын активдүүлүгү:
16 саат бою 37℃ температурада 1μ г λ ДНКсы бар 40 U сылык RNase ингибитору агароз гели электрофорези менен аныкталгандай деградацияны бербейт.
Nicking Иш-аракет:
16 саат бою 37 ℃ температурада 1μг pBR322 менен 40U чычкан RNase ингибитору агароз гел электрофорези менен аныкталгандай деградацияны бербейт.
RNase Активдүүлүк:
37℃ температурада 4 саат бою 1,6μг MS2 РНКсы бар 40U чычкан RNase ингибитору агароз гелинин электрофорези менен аныкталгандай деградацияны бербейт.
E.coli ДНКсы:
Сычык RNase ингибиторунун 40 U E. coli геномдук ДНКсынын бар-жогуна E. coli 16S рРНК локусуна мүнөздүү праймерлер менен TaqMan qPCR аркылуу текшерилет.E. coli геномдук ДНК булганышы ≤ 0,1 pg/40 U.
Nотеs
1.Күчтүү термелүү же аралаштыруу ферменттин инактивацияланышына алып келет.
2. Бул ингибитордун оптималдуу температура диапазону 25-55 ℃ болгон, ал эми 65 ℃ жана андан жогору болгон.
RNase H, RNase 1 жана RNase T1 3.The иш-мердик RNase ингибиторун тоскоол болгон эмес.
4.RNase активдүүлүгүн бөгөт коюу рНнын кеңири диапазонунда (рН 5-9 бардык активдүү болгон) табылган жана эң жогорку активдүүлүк рН 7-8де байкалган.
5. Рибонуклеазалар денатурациялоо шарттарында демейде активдүүлүгүн сактап калгандыктан, рибонуклеаза менен комплекстүү болгон RNase ингибиторунун молекулаларын денатурациялоодон сактануу керек.Активдүү рибонуклеазанын бөлүнүп чыгышына жол бербөө үчүн 50 °Cден жогору температурадан жана карбамид же башка денатурациялоочу агенттердин жогорку концентрациясынан качуу керек.
