ДНК экстракциясынын мини комплекти
Бул комплект оптималдаштырылган буфердик системаны жана силикагель мамычасын тазалоо технологиясын кабыл алат, ал TAE же TBE агароз гелинин ар кандай концентрацияларынан 70 bp – 20 кб ДНК фрагменттерин калыбына келтире алат.ДНК адсорбция колонкасы өзгөчө туз шартында ДНКны адсорбциялай алат.Мындан тышкары, комплект ДНК фрагменттерин ПЦР продуктуларынан, ферменттик реакция системаларынан же башка ыкмалар менен алынган чийки ДНК продуктуларынан түздөн-түз тазалап, протеиндер, башка органикалык кошулмалар, органикалык эмес туз иондору жана олигонуклеотиддик праймерлер сыяктуу кирлерди жок кыла алат.Бул тазалоо 10-15мин ичинде аякташы мүмкүн экенин камсыз кыла алат.Тазаланган ДНК түздөн-түз лигация, трансформация, ферменттерди сиңирүү, in vitro транскрипция, ПТР, секвенирлөө, микроинъекция ж.б. үчүн колдонсо болот.
Сактоо шарттары
-15 ~ -25 ℃ температурада сактоо жана бөлмө температурасында ташуу.
Компоненттер
| Компоненттер | (100 rxns) |
| Буфердик ИДП | 80 мл |
| Буфер GW | 2 × 20 мл |
| Элюциялык буфер | 20 мл |
| FastPure DNA Mini Columns-G | 100 |
Буфердик ИДП:ДНКны байланыштыруучу буфер.
Буфер GW:жуугуч буфер;колдонуудан мурун бөтөлкөдөгү көрсөтүлгөн көлөмгө абсолюттук этанолду кошуңуз.
Элюциялык буфер:Элюция.
FastPure DNA Mini Columns-G:ДНК адсорбция мамычалары.
Коллекциялык түтүктөр 2 мл:Фильтрат үчүн жыйноочу түтүктөр.
Даярдалган материалдар
1,5 мл стерилденген түтүктөр, абсолюттук этанол жана изопропанол (ДНК фрагменти ≤100 bp болгондо, 1 көлөмдү кошуңуз)
изопропанолдон 1 көлөмгө чейин гель), суу ваннасы.
Эксперимент процесси
Колдонуудан мурун буфер GWти суюлтуу үчүн 80 мл этанолду кошуп, бөлмө температурасында сактаңыз.
Механизм
1. ПЦР реакциясы
Гель экстракция схемасы: Бирдей көлөм кошуу буфердик GDP ПТР реакциясы эритмесин калыбына келтирүү схемасы:5 эсе чоң буферди кошуңуз
2. ИДП гелдин көлөмүн эсептөө (100 μл 100 мг барабар)
Гельди эритүү
3. 50 ~ 55 чейин ысытыңыз℃
4. Bind Wash
300 мкл буфердик ИДП кошуңуз*
700 мкл буфер GW кошуңуз
700 мкл буфер GW кошуңуз
5. Elute
20 – 30 мкл Элюция буферин же деионизацияланган сууну кошуңуз
Эскертүү* Бул кадамсыз ПТР реакциясы суюктугун калыбына келтирүү
Гель экстракциялоо программасы
1. ДНК фрагменттерин фракциялоо үчүн ДНК электрофорезинен кийин, агароза гелинен ДНК фрагментинин бир тилкесин УК жарыгынын астында акцизден чыгарыңыз.Гельдин көрүнгөн нымын сиңирүү жана мүмкүн болушунча кошумча агарозду алып салуу менен гелдин кесиминин өлчөмүн азайтуу үчүн абсорбент кагазды колдонуу сунушталат.Анын көлөмүн эсептөө үчүн гелдин кесиндисин (микроцентрифугасыз) таразалаңыз: тыгыздыгы 1г/мл деп эсептегенде 100 мг гелдин көлөмү болжол менен 100 мкл болот.
2. Бирдей көлөмдөгү буфердик GDP кошуңуз, 50~55℃ температурада 7-10 мүнөт инкубациялаңыз (гелдин өлчөмүнө жараша гель толук эригенге чейин инкубация убактысын тууралаңыз).Инкубация учурунда түтүктү 2 жолу которуңуз.
Δ Буфердик ИДПнын 1-3 көлөмүн кошуу ДНКны калыбына келтирүү эффективдүүлүгүнө таасир этпейт.Эгерде ДНК фрагменти калыбына келтириле турган болсо, <100 bp, буфердик ИДПнын 3 томдугун кошуу керек;гелдин кесими толугу менен эрип кеткенде, изопропанолдун 1 көлөмүн кошуп, жакшылап аралаштырыңыз, андан кийин кийинки кадамга өтүңүз.
3. Үлгүнү түтүктүн түбүнө алып келүү үчүн кыскача центрифугалаңыз, FastPure DNA Mini Columns-G 2 мл коллекциялык түтүктөргө салыңыз, эритмени 700 мкл максималдуу түрдө күнүнө бир жолу кылдаттык менен өткөрүп бериңиз.
чыпкалоо колонкаларына чейин убакыт, 12,000 айн/мин (13,800 X г) 30-60 сек центрифуга.
4. Фильтратты ыргытыңыз жана колонкага 300 мкл буфердик GDP кошуңуз, бөлмө температурасында 1 мүнөт инкубациялаңыз, 12 000 айн/мин (13 800 X г) 30-60 сек центрифугалаңыз.
5. Фильтратты ыргытыңыз жана колонкага 700 мкл Buffer GW (абсолюттук этанол кошулганын алдын ала текшериңиз!) кошуңуз, 12 000 айн/мин (13 800 X г) 30-60 сек центрифугалаңыз.
Δ Сураныч, адсорбция колоннасынын дубалынын тегерегине Bufer GW кошуңуз же буфердик GW арткы капкагын кошуп, түтүктүн дубалына жабышкан тузду толугу менен жууп салууга жардам берүү үчүн аны тескери 2-3 жолу аралаштырыңыз.
6. 5-кадамды кайталаңыз.
Δ Buffer GW менен эки жолу жуу, туздун толугу менен жок кылынышын камсыздай алат жана кийинки эксперименттерге таасирин жок кылат.
7. Фильтратты таштаңыз жана бош колонканы 12 000 айн/мин (13 800 X г) 2 мүнөткө центрифугалаңыз.
8. Колонканы таза 1,5 мл микроцентрифуга түтүгүнө салыңыз, колонна мембранасынын ортосуна 20 - 30 мкл Элюция буферин кошуп, 2 мүнөт инкубациялаңыз, андан кийин 12 000 айн/мин (13 800 X г) 1 мүнөткө центрифугалаңыз.Колонканы таштаңыз, алынган ДНКны -20да сактаңыз.
Δ 8-кадамдагы супернатантты кайра элюциялоо үчүн колонкага өткөрүп берүү жана Элюция буферин 55ке чейин алдын ала ысытуу (ДНК фрагменти >3 кб болгондо) калыбына келтирүүнүн натыйжалуулугун жогорулатуу үчүн пайдалуу болушу мүмкүн.
ПЦР продуктуларын калыбына келтирүү программасы
Бул протокол ДНК фрагменттерин ПТР продуктуларынан, ферменттик реакция системасынан жана башка ДНК чийки продуктыларынан (анын ичинде генетикалык ДНК) тазалоо үчүн колдонулат.Бул чечим ар кандай нуклеотиддерди, праймерлерди, праймердик димерлерди, туздун молекулаларын, ферменттерди жана башка аралашмаларды эффективдүү түрдө жок кыла алат.
1. ПЦР продуктуларын, ферменттик реакция эритмесин жана башка ДНК чийки продуктуларын кыскача центрифугалаңыз.Пипетка менен алардын көлөмүн эсептеп, стерилденген 1,5 мл же 2 мл пробиркага өткөрүңүз.ddH2O кошуу көлөмү 100 мкл чейин;ал эми жогорку концентрациядагы геномдук ДНК үчүн ddH2O менен 300 мкл чейин суюлтуу калыбына келтирүүнүн натыйжалуулугун жогорулатууга жардам берет.
2. Буфердик ИДПнын 5 томдугун кошуп, тескери айландыруу же бургулоо жолу менен кылдат аралаштырыңыз.Кызыккан ДНК фрагменти >100 bp болсо, этанолдун кошумча 1,5 томун (үлгүлөр + буфердик ИДП) кошуу керек.
3. Колонканы кайра чогултуучу түтүккө киргизиңиз, аралашманы колонкага өткөрүп алыңыз, 12 000 айн/мин (13 800 × г) 30 – 60 сек центрифугалаңыз.Эгерде аралаш эритменин көлөмү >700 мкл болсо, адсорбциялык колонканы кайра чогултуу түтүкчөсүнө салып, калган эритмени адсорбциялык колонкага өткөрүп, 12 000 айн/мин (13 800 × г) 30 – 60 сек центрифугалаңыз.
4. Кийинки аткаруу 08- 1/Gel экстракциялоо программасынын 5 – 8 кадамына тиешелүү.
Тиркемелер
TAE же TBE агароз гелинин ар кандай концентрациясы;Ар кандай ыкмалар менен алынган ПТР продуктулары, ферменттик реакция системалары же башка чийки ДНК продуктулары.Калыбына келтирилген сыныктары чейин өзгөрдү70 bp -20 кб.
Эскертүүлөр
изилдөө үчүн гана.Диагностикалык процедураларда колдонуу үчүн эмес.
1. Колдонуудан мурун буфер GW суюлтуу үчүн 80 мл этанолду кошуп, бөлмө температурасында сактаңыз.
2. Эгерде буфердик ИДПны төмөнкү температурада сактоодо чөктүрүүгө оңой болсо, аны колдонуудан мурун бөлмө температурасында бир нече убакытка коюуга болот.Зарыл болсо, аны 37℃ суу мончосунда чөкмө толугу менен эригенге чейин ысытса болот, андан кийин аралаштыргандан кийин колдонсо болот.
3. Суу ваннасынын температурасын алдын ала 50 ~ 55℃ кылып коюңуз.
4. 08-1/Gel экстракциялоо программасынын 1-кадамында гелдин кесиминин өлчөмүн азайтуу эрүү убактысын бир топ кыскартат жана калыбына келтирүү эффективдүүлүгүн жогорулатат (Линеаризацияланган ДНК жогорку температурада үзгүлтүксүз гидролизге өтөт).Ультрафиолет нуру ДНКнын бузулушуна алып келиши мүмкүн болгондуктан, ДНК гелин УК нурга көпкө тийгизбеңиз.
5. Гельди 08- 1/Gel экстракциялоо программасынын 2-кадамында толугу менен эритип алыңыз, антпесе ДНКны калыбына келтирүү эффективдүүлүгү олуттуу түрдө жабыркайт.
6. Элюциялык буферди же ddH2Oну 55℃ чейин алдын ала ысытыңыз, бул ДНКнын элюциясынын натыйжалуулугун жогорулатууга жардам берет.ДНКны 2,5 мМ Tris-HCl, рН 7,0 – 8,5 элюентте сактоо сунушталат.
