Plant Direct PCR Kit

Cat №: HCR2020A

Plant Direct PCR Kit өсүмдүктүн жалбырактарын, уруктарын ж.б. түз күчөтүү үчүн ылайыктуу жана полисахариддерди жана полифенолдорду камтыбаган өсүмдүк үлгүлөрүн жогорку өндүрүмдүүлүктө скрининг үчүн колдонсо болот.Багытталган эволюциянын негизинде түз күчөтүлгөн ДНК полимеразасы өсүмдүктөрдөгү ПТР ингибиторлоруна жогорку толеранттуулукка ээ.Ошол эле учурда, ал 5 кб ичинде ДНК фрагменттерин күчөтүү үчүн ылайыктуу болгон жогорку күчөтүү көрсөткүчтөрүн сактап турат.Комплекттеги уникалдуу Lysis буфери А жаңы же тоңдурулган өсүмдүк ткандарын лизис үчүн колдонсо болот.Аны иштетүү оңой жана лизат тазалоосуз күчөтүү үчүн шаблон катары колдонулушу мүмкүн.Системада чийки үлгүлөрдү кайра-кайра тоңдурууда жана эрүүдөн кийин эффективдүү күчөтүүгө мүмкүндүк берген коргоочу агенттер бар.2 × Plant Direct Master Mix күчөтүү реакциясын аткаруу үчүн праймерлерди жана шаблондорду кошуусу керек, ошону менен пиптинг операцияларын азайтып, аныктоо өткөрүү жөндөмдүүлүгүн жана натыйжалардын кайталанышын жакшыртат.

Компоненттер

*Plant Direct Lysis Buffer B - бул кошумча реагент, ал өсүмдүктүн тике лизис буфери А үлгүлөрдү сактоо убактысын узартуу үчүн нейтралдаштыруу үчүн колдонулат.Аны чыныгы кырдаалга жараша колдонсо болот.

Сактоо шарттары

2 × Plant Direct Master Mix, сактоо -30 ~ -15 ℃ жана кайра-кайра тоңдуруу жана эрүү качуу;Өсүмдүктүн түз лизис буфери, -30 ~ -15 ℃ же 2 ~ 8 ℃ сактаңыз.

Эксперимент процесси

Үлгү иштетүү–Өсүмдүк жалбырагы

Түздөн-түз ыкмасы:Бул жаш жалбырактарын пайдалануу сунуш кылынат.Кичинекей жана бирдей үлгү алуу үчүн 0,5 – 3 мм белгиленген диаметри бар тешикти колдонуңуз, андан кийин үлгүнү ПТР системасына түз кошуңуз (50 мкл системасы сунушталат).Көңүл буруңуз, үлгү ПТР эритмесинде экенин жана түтүк дубалына каршы эмес экенин текшериңиз.Эгерде түз ПТР узун фрагменттерди жана татаал үлгүлөрдү күчөтүү үчүн колдонулса, шаблон катары диаметри кичине (0,5 – 1 мм) үлгүнү колдонуу жакшы натыйжаларды алууга жардам берет.

Майдалоо лизис ыкмасы:Бул жаш жалбырактарын пайдалануу сунуш кылынат.Жалбырактын кичинекей бөлүгүн (диаметри болжол менен 1 – 3 мм) алып, 20 мкл Plant Direct Lysis Buffer Abга салып, мүмкүн болушунча майдалаңыз (бул кадамды жалбыракты 100 мкл пипетка учу менен кысуу менен жасоого болот. үлгүнү эзүү үчүн).Эгерде жалбырак тканынын чоңураак көлөмү колдонулса (7 ммден ашпаса), суюлтуу буферинин көлөмүн 50 мклге чейин көбөйтүү керек.жалбырактары майдалангандан кийин, чечим жашыл болушу керек.Кыскача центрифугалоодон кийин ПТР системасына 1 мкл супернатантты реакция калыбы катары кошуңуз.

Термикалык лизис ыкмасы:Бул жаш жалбырактарын пайдалануу сунуш кылынат.Жалбырактын кичинекей бөлүгүн (диаметри болжол менен 1 – 3 мм) алып, 20 мкл Өсүмдүк түз лизис буферине салып, 95°C температурада 5 – 10 мүнөт ысытыңыз.Лизис убактысын лизис кыйын болгон жалбырактар ​​үчүн ылайыктуу түрдө узартса болот (20 мүнөттөн ашык эмес).Эгерде жалбырак тканынын чоңураак көлөмү колдонулса (7 ммден ашпаса), суюлтуу буферинин көлөмүн 50 мклге чейин көбөйтүү керек.Ысытуудан кийин кыска убакытка центрифугалап, реакция калыптары катары ПЦР системасына 1 мкл супернатант кошуңуз.

Үлгү иштетүү- Өсүмдүк үрөнү

Майдалоо лизис ыкмасы:Диаметри 5 мм болгон уруктарды кесүү үчүн скальпельди колдонуңуз, аларды 100 мкл Plant Direct Lysis Buffer Aга кошуп, үлгүнү пипетка учу же башка шаймандар менен майдалаңыз.Кыскача Vortex жана 3 үчүн бөлмө температурасында турсун - 5 мүнөт.Үрөн үлгүсү суюлтуу буферине чөмүлгөнүн текшериңиз.Кыскача центрифугалоодон кийин реакция үлгүсү катары ПТР системасына 1 мкл супернатант кошуңуз.

Термикалык лизис ыкмасы:Диаметри 5 мм болгон уруктарды кесүү үчүн скальпельди колдонуңуз, аларды 100 мкл Plant Direct Lysis Buffer Aга кошуп, 95°C температурада 5 – 10 мүнөт ысытыңыз.Лизис убактысын лизиси кыйын болгон жалбырактар ​​үчүн ылайыктуу түрдө узартса болот (30 мүнөттөн ашык эмес).Ысытуудан кийин кыска убакытка центрифугалап, реакция калыптары катары ПТР системасына 1 мкл супернатант кошуңуз.

а.Кайчы же башка куралдар да ылайыктуу өлчөмдөгү үлгүлөрдү кесип үчүн колдонулушу мүмкүн;эгерде пуансон же кайчы кайра колдонулса, алар үлгүлөрдүн ортосунда кайчылаш булганууну болтурбоо үчүн ар бир колдонуунун алдында 2% натрий гипохлорит эритмеси менен тазаланууга тийиш.

б.Колдонуудан мурун Өсүмдүктүн түз лизис буфери толугу менен эрип кеткенин текшериңиз.Буфер илешкектүү же чөкмөлүү болсо, аны колдонуудан мурун толугу менен эритүү үчүн 37℃ га чейин ысытса болот.

в.Реакция тутумундагы шаблондун көлөмү өсүмдүк материалынын жана кошулган эриткичтин көлөмүнүн айырмасына ылайык тийиштүү түрдө жөнгө салынышы мүмкүн.

Өсүмдүктүн түз лизис буфери

Бул продуктунун курамындагы Plant Direct Lysis Buffer A катуу оптималдаштырылган жана көпчүлүк өсүмдүк кыртыштарынын геномун чыгаруу үчүн оптималдаштырылган жана чийки өсүмдүктөрдү 4℃ температурада кыска мөөнөттүү сактоого ылайыктуу.Эгерде үлгүнү узак убакытка сактоо керек болсо (мисалы, 1 – 2 ай), супернатантты жаңы EP түтүкчөсүнө өткөрүп, аны -20℃ температурада сактоо сунушталат.Үлгүлөрдү туруктуураак сактоо үчүн, өткөрүлүп берилген супернатантка бирдей көлөмдөгү Plant Direct Lysis Buffer B кошуп, жакшылап аралаштырыңыз жана -20℃ температурада сактаңыз.Туруктуу сактоо мөөнөтү өсүмдүк үлгүлөрү жана мамлекеттер менен айырмаланат.

Реакция системасы

а.Анын курамында Mg²⁺акыркы концентрациясында 2 мм.

б.Ар бир праймер үчүн 0,4μM акыркы концентрациясын колдонуу сунушталат.Примерлерди ашыкча колдонуу спецификалык эмес күчөтүүнүн көбөйүшүнө алып келет.

в.Колдонулган үлгүнүн көлөмү иш жүзүндөгү кырдаалга жараша жөнгө салынышы мүмкүн.Чийки лизиденген үлгүнүн бир реакциясында колдонулган сумманы реакциянын жалпы көлөмүнүн 2% - 20% ортосунда жөнгө салууга болот.Өтө көп үлгүлөрдү колдонуу күчөтүү иштебей калышына алып келиши мүмкүн.

Реакция программасы

а.Баштапкы денатурация (98℃, 5 мүн.) өсүмдүк кыртышынын лизисине өбөлгө түзүп, ПТР күчөтүү үчүн колдонула турган геномдук ДНКны бөлүп чыгарат.Убакытты кыскартпаңыз же температураны төмөндөтүңүз.

б.Аны праймердин Tm маанисине барабар же Tm маанисинен 2 ~ 4℃ жогору коюу сунушталат.Бул продуктта колдонулган түз күчөтүү ДНК полимеразасы кадимки Taq ДНК полимеразасынан айырмаланат жана реакцияны күйгүзүү температурасына атайын талаптары бар; жогорку күйгүзүү температурасын колдонуу спецификалык эмес күчөтүүнү эффективдүү азайтып, күчөтүү эффективдүүлүгүн жакшыртат.Татаал калыптар үчүн эффективдүү күчөтүүгө күйгүзүү температурасын жөнгө салуу жана узартуу убактысын узартуу аркылуу жетишүүгө болот.

в.Эгерде күчөтүү продуктунун узундугу ≤1 кб болсо, узартуу убактысы 30 сек/кб деп белгиленет;эгерде күчөтүү продуктунун узундугу >1 кб болсо, узартуу убактысы 60 сек/кб деп белгиленет.

г.Татаал үлгүлөр же күчөтүү кирешеси төмөн үлгүлөр үчүн циклдердин санын тийиштүү түрдө 40 -50 циклге чейин көбөйтүүгө болот.

Тиркемелер

Бул өсүмдүк кыртыштарын түздөн-түз күчөтүү жана полисахариддерди жана полифенолдорду камтыбаган өсүмдүк үлгүлөрүн жогорку өндүрүштүк скрининг үчүн колдонулат.

Эскертүүлөр

изилдөө үчүн гана.Диагностикалык процедураларда колдонуу үчүн эмес.

1. Өсүмдүктүн чийки өстүрүү же түз күчөтүү үчүн системанын, праймерлердин жана операциялардын туура болушун камсыз кылуу үчүн экспериментти баштоодон мурун позитивдүү башкаруу катары тазаланган геномдук ДНКны колдонуу сунушталат.

2. Бул комплектте колдонулган түз күчөтүү ДНК полимеразасы күчтүү текшерүү активдүүлүгүнө ээ.Эгерде ТА клондоштуруу керек болсо, аденинди кошуудан мурун ДНКны тазалоо сунушталат.

3. Праймерди долбоорлоо боюнча көрсөтмө:

а.Праймердин 3′ учундагы акыркы негиз G же C болушу сунушталат.

б.Праймердин 3′ аягындагы акыркы 8 базада ырааттуу дал келбөөчүлүктөрдү болтурбоо керек.в.Праймердин 3′ учундагы чач кычкач структураларынан качыңыз.

г.Алдыңкы праймер менен арткы праймердин Tm маанисиндеги айырмачылыктар 1℃ ашпоого тийиш жана Tm мааниси 60 ~ 72℃ге туураланышы керек (Primer Premier 5 Tm маанисин эсептөө үчүн сунушталат).

д.Үлгү менен дал келбеген кошумча кошумча праймер ырааттуулугу праймердин Tm маанисин эсептөөдө киргизилбеши керек.

f.Бул праймердин GC мазмуну 40% -60% болушу сунушталат.

г.А, Г, С жана Т-нын праймердеги жалпы бөлүштүрүлүшү мүмкүн болушунча бирдей болушу керек.GC же AT мазмуну жогору аймактарды колдонуудан качыңыз.

ч.Праймердин ичинде же эки праймердин ортосунда 5 же андан көп негиздердин кошумча тизмектеринин болушуна жол бербеңиз жана эки праймердин 3′ аягындагы 3 же андан көп негиздердин кошумча тизмектеринин болушун болтурбаңыз.

и.Спецификалык эмес күчөтүүнү болтурбоо үчүн праймердин өзгөчөлүгүн текшерүү үчүн NCBI BLAST функциясын колдонуңуз.