2×Sensi Direct Premix-UNG (Probe qPCR)
Cat №: HCB5151A
SensiDirect Premix-UNG (Probe qPCR) ДНКны экстракциялоосуз же үлгү даярдоосуз үлгүлөрдөн түздөн-түз ПТР жүргүзүү үчүн иштелип чыккан.Бул реагент ысык башталгыч ДНК полимеразадан, урацил ДНК гликозилазадан (UNG), RNase ингибиторунан, MgClден турат.2, dNTPs (dTTP ордуна dUTP менен) жана стабилизаторлор, сандык ПТР (qPCR).Бул реагент ингибиторлорго толеранттуулуктун жогорку деңгээлин көрсөтөт, ошондуктан аны ДНК экстракциясы жок тамактын тампону, шилекей, антикоагуляцияланган кан, плазма жана сарысу сыяктуу үлгүлөрдү аныктоого түздөн-түз колдонсо болот.Реагент антиингибитор ДНК полимеразанын жана UNG ферментинин аралаш ферменттери менен qPCR үчүн менчик буферди колдонот.Демек, ал ингибиторлорду камтыган үлгүлөрдөгү максаттуу гендердин жакшы күчөтүлүшүн ала алат жана ПТР калдыктары жана аэрозолдук булгануудан келип чыккан жалган оң күчөтүүнү токтото алат.Бул реагент Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad, Roche жана башкалар сыяктуу флуоресценттик сандык ПТР аспаптарынын көбү менен шайкеш келет.
Компоненттер
1. 50×SensiDirect Enzyme/UNG Mix
2. 2×SensiDirect Premix буфери (dUTP)
Сактоо шарттары
Бардык компоненттер узак мөөнөттүү сактоо үчүн -20 ℃ жана 4 ℃ 3 айга чейин сакталышы керек.Эриткенден кийин жакшылап аралаштырыңыз жана колдонуудан мурун центрифугалаңыз.Тез-тез тоңуп-эрүүдөн качыңыз.
Cycling Protocol
| Кадам | Температура | Убакыт | Цикл |
| Тамак сиңирүү | 50℃ | 2мин | 1 |
| Полимеразды активдештирүү | 95℃ | 1-5мин | 1 |
| Денатура | 95℃ | 10-20с | 40-50 |
| Күйүү/узартуу | 56-64℃ | 20-60с |
Пипеттүү инструкциялар
| Реагент | Көлөмү реакция | Реакциянын көлөмү | Акыркы концентрация |
| 2×SensiDirect Premix буфери (dUTP) | 12.5μL | 25μL | 1× |
| 50×SensiDirect Enzyme/UNG Mix | 0.5μL | 1μL | 1× |
| 25×Праймер-Зонд аралашмасы1, 2 | 1μL | 2μL | 1× |
| Үлгү3, 4 | - | - | - |
| ddH2O | - | - | - |
| Жалпы көлөмү | 25 мкл | 50 мкл | - |
1. Праймердин акыркы концентрациясы, адатта, 0,2μM.Жакшыраак натыйжалар үчүн, праймердин концентрациясын 0,2-1μM чегинде оптималдаштырса болот.
2. Жалпысынан, иликтөө топтолуу 0.1-0.3μM чегинде оптималдаштырылган болот.Зонддун оптималдуу концентрациясы реалдуу убакыттагы ПТР күчөтүү аспабына, зонддун түрүнө жана флуоресценттик белгилөөчү заттын түрүнө байланыштуу.Сураныч, аспаптын колдонмосун же ар бир флуоресценттик зонддун атайын талаптарын караңыз.
3. Үлгүлөрдүн ар кандай түрлөрү ингибитордун ар кандай түрлөрүн жана мазмунун жана максаттуу гендин копия санын камтыйт.Үлгү көлөмү чыныгы шарт менен каралышы керек.Зарыл болсо, нуклеазасыз сууну же TE буферин кошуу менен үлгүнү суюлтуңуз.
4. Ар кандай үлгүлөрдүн сунушталган көлөмү:
| Үлгү | Көлөмү бир 50 мкл реакция | Максималдуу катышы |
| Антикоагулянтталган бүт кан | 2,5 мкл | 5% |
| Плазма | 15 мкл | 30% |
| Сарысу | 10 мкл | 20% |
| Тампон тампон | 10 мкл | 20% |
| шилекей | 10 мкл | 20% |
Сапатты көзөмөлдөө
1. Функцияны аныктоо: qPCRдин сезгичтиги, өзгөчөлүгү жана кайталануучулугу.
2. Экзогендик нуклеаздык активдүүлүк жок: экзогендик эндонуклеаза жана экзонуклеаза булгануусу жок.
Продукт боюнча эскертүүлөр
1. Бул продукт 1-5 мүнөт ичинде активдештире турган ысык баштоо ДНК полимеразасынын жаңы түрүн колдонот. Анын реакция буфери оптималдаштырылгандыктан, ал эки же көп флуоресценттик сандык ПТР үчүн зонд ыкмасын колдонуу үчүн көбүрөөк ылайыктуу.
2. Эгерде ПТР күчөтүүнүн Rn мааниси өтө төмөн болсо же күчөтүү ачык түрдө бөгөттөлсө, үлгүнүн көлөмүн азайтуу, реакциянын көлөмүн көбөйтүү же үлгүнү мурунку суюлтуу натыйжаларды жакшыртышы мүмкүн.
3. Канды, шилекейди, заараны, тамактын тампонун ж.б. чогултуу клиникалык критерийлердин талаптарына жооп бериши керек жана жаңы үлгү нуклеин кислотасынын бузулушун алдын алуу үчүн колдонулушу мүмкүн.
4. Ар кандай ампликондордун dUTPге карата колдонуу эффективдүүлүгү жана UNGге сезгичтиги ар кандай болгондуктан, UNG системасын колдонууда аныктоо сезгичтиги азайса, реагенттерди оптималдаштыруу керек.Керек болсо техникалык колдоо үчүн биз менен байланышыңыз.
5. Бир кадамдуу реакциялардын ортосунда ПТР продуктуларынын күчөшүнө жол бербөө үчүн күчөтүү үчүн атайын эксперименталдык аянт жана пипетка керек.Перчатки менен операция жасаңыз жана тез-тез алмаштырыңыз жана ПТР күчөтүлгөндөн кийин реакция түтүгүн ачпаңыз.
