Протеиназа K NGS (порошок)
Cat №: HC4507A
NGS Protease K - жогорку фермент активдүүлүгү жана кең субстрат өзгөчөлүгү менен туруктуу сериндик протеаза. Фермент гидрофобдук аминокислоталардын, күкүрт камтыган аминокислоталардын жана ароматтык аминокислоталардын C-терминалына жакын эфирдик байланыштарды жана пептиддик байланыштарды артыкчылыктуу ажыратат.Ошентип, ал көбүнчө протеиндерди кыска пептиддерге ажыратуу үчүн колдонулат.NGS Protease K Asp менен типтүү сериндик протеаза болуп саналат39- Анын69-Сер224каталитикалык үчилтик, ал сериндик протеазаларга гана таандык, ал эми каталитикалык борбору Ca чиркегичтери менен курчалган.2+шарттын кененирээк диапазонунда жогорку ферменттик активдүүлүгүн сактоо, турукташтыруу үчүн милдеттүү сайттар.
Спецификация
| Көрүнүш | Ак-ак түстөгү аморфтук порошок, лиофилизацияланган |
| Өзгөчө активдүүлүк | ≥40U/мг катуу |
| DNase | Эч ким табылган жок |
| RNase | Эч ким табылган жок |
| Биологиялык жүк | ≤50CFU/г катуу |
| Нуклеин кислотасынын калдыктары | <5пг/мг катуу |
Properties
| Булак | Tritirachium альбому |
| EC номери | 3.4.21.64(Tritirachium альбомунан рекомбинант) |
| Молекулярдык салмак | 29 кДа (SDS-PAGE) |
| Изоэлектрдик чекит | 7.81 1-сүрөт |
| Оптималдуу рН | 7.0-12.0 (Баары жогорку активдүүлүктү аткарышат) 2-сүрөт |
| Оптималдуу температура | 65℃ 3-сүрөт |
| рН туруктуулугу | pH 4,5-12,5 (25℃,16с) 4-сүрөт |
| Термикалык туруктуулук | 50℃ төмөн (pH 8.0, 30мин) 5-сүрөт |
| Сактоо туруктуулугу | 25℃ температурада 12 ай сакталат Fig.6 |
| Активаторлор | СДС, мочевина |
| Ингибиторлор | диизопропил фторофосфат;бензилсульфонил фториди |
Сактоо шарттары
Лиофилизацияланган порошокту жарыктан алыс узак убакытка -25~-15 ℃ температурада сактаңыз;Эригенден кийин, аликвотту ылайыктуу көлөмдө кыска мөөнөттүү сактоо үчүн 2-8 ℃ жарыктан алыс же узак мөөнөттүү сактоо үчүн -25 ~ -15 ℃ жарыктан алыс.
Cактык чаралары
Колдонууда же таразалоодо коргоочу кол каптарды жана көз айнектерди кийиңиз жана колдонгондон кийин жакшы желдетип туруңуз.Бул продукт теринин аллергиялык реакциясын жана олуттуу көздүн кыжырдануусун жаратышы мүмкүн.Дем алган болсо, ал аллергия же астма симптомдорун же дем алуусун келтириши мүмкүн.Дем алуу органдарынын кыжырдануусун пайда кылышы мүмкүн.
Бирдиктин аныктамасы
NGS Protease K бир бирдиги стандарттык аныктоо шарттарында казеинди 1 мкмоль L-тирозинге гидролиздөө үчүн зарыл болгон ферменттин көлөмү катары аныкталат.
Реагенттерди даярдоо
| Реагент | Өндүрүүчү | Каталог |
| Казеин техникалыкуйдун сүтүнөн | Сигма Олдрих | C7078 |
| NaOH | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10019762 |
| NaH2PO4·2H2O | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 20040718 |
| Na2HPO4 | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 20040618 |
| Trichloroacetic кислотасы | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 80132618 |
| Натрий ацетаты | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10018818 |
| Уксус кислотасы | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10000218 |
| HCl | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10011018 |
| Натрий карбонаты | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10019260 |
| Фолин-фенол | Sangon Biotech (Шанхай)Co., Ltd. | A500467-0100 |
| L-тирозин | Сигма | 93829 |
Реагент I:
Субстрат: бодо сүтүнүн эритмесинен алынган 1% казеин: 1 г уй сүтүнүн казеинди 50 мл 0,1 М натрий фосфат эритмесинде эритип, рН 8,0, суу мончосунда 65-70 °C 15 мүнөт ысытып, аралаштырып, эритип, суу менен муздатып, төмөнкүдөй жөнгө салат. натрий гидроксиди рН 8.0 чейин, жана 100мл чейин суюлтулган.
Реагент II:
TCA эритмеси: 0,1М трихлорацета кислотасы, 0,2М натрий ацетаты жана 0,3М уксус кислотасы (салмагы 1,64 г трихлорацета кислотасы + 1,64 г натрий ацетаты + 1,724 мл уксус кислотасы катары менен, 50 мл деионизацияланган сууну кошуп, H30 менен суюлтуңуз жана pH4. 100 мл).
Реагент III:
0,4 м натрий карбонат эритмеси (салмагы 4,24 г суусуз натрий карбонаты жана 100 мл сууда эрийт)
IV реагент:
Фолин фенол реагент: 5 жолу деионизацияланган суу менен суюлтуңуз.
Реагент V:
Фермент эриткичи: 0,1 М натрий фосфат эритмеси, рН 8,0.
VI реагент:
L-тирозин стандарттуу эритмеси: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml L-тирозин 0,2M HCl менен эриген.
Процедура
1. UV-Vis спектрофотометрин күйгүзүңүз жана фотометрикалык өлчөөнү тандаңыз.
2. Толкун узундугун 660нм деп коюңуз.
3. Суу мончосун күйгүзүңүз, температураны 37℃ге орнотуңуз, температураны 3-5 мин өзгөрбөстөн камсыз кылыңыз.
4. 0,5 мл субстратты 2 мл центрифугалык түтүктө 37℃ суу мончосунда 10 мүнөткө алдын ала ысытыңыз.
5. Алдын ала ысытылган центрифуга түтүкчөсүнө 0,5 мл суюлтулган фермент эритмени 10 мүнөткө чыгарып алыңыз.Энзим эриткичти бош топ катары коюңуз.
6. Реакциядан кийин дароо 1,0 мл TCA реагент кошуңуз.Жакшылап аралаштырып, суу мончосунда 30 мүнөт инкубациялаңыз.
7. Реакция эритмесин центрифугалоо.
8. Төмөнкү компоненттерди көрсөтүлгөн тартипте кошуңуз.
| Реагент | Көлөм |
| Супернатант | 0,5 мл |
| 0,4 М натрий карбонаты | 2,5 мл |
| Фолин фенол реагент | 0,5 мл |
9. 37℃ суу мончосунда 30 мүнөт инкубациялоонун алдында жакшылап аралаштырыңыз.
10. ОД660ОД деп аныкталган1;бош башкаруу тобу: OD аныктоо үчүн фермент эритмесин алмаштыруу үчүн фермент эритүүчү колдонулат660катары OD2, ΔOD=OD1-OD2.
11. L-тирозиндин стандарттык ийри сызыгы: 0,5 мл ар кандай концентрациядагы L-тирозин эритмеси, 2,5 мл 0,4 М натрий карбонаты, 5 мл центрифугалык түтүктөгү 0,5 мл фолин фенол реагент, 37 ℃ температурада 30 мүнөт инкубациялоо, ОД үчүн аныктоо660L-тирозиндин ар кандай концентрациясы үчүн, андан кийин стандарттык ийри Y=kX+b алынган, мында Y L-тирозин концентрациясы, X – OD600.
Эсептөө
2: Реакция эритмесинин жалпы көлөмү (мл)
0,5: Фермент эритмесинин көлөмү (мл)
0,5: хромогендик аныктоодо колдонулган суюктуктун реакциясынын көлөмү (мл)
10: Реакция убактысы (мин)
Df: Көп суюлтуу
C: Фермент концентрациясы (мг/мл)
Фигуралар
Fig.1 ДНК калдыктары
| Үлгү | Ave C4 | Нуклеин кислотасы Калыбына келтирүү (пг/мг) | Калыбына келтирүү(%) | Жалпы нуклеиндик кислота ( пг/мг) |
| PRK | 24.66 | 2.23 | 83% | 2.687 |
| PRK+STD2 | 18.723 | 126.728 | — | — |
| STD1 | 12.955 |
— |
— |
— |
| STD2 | 16 | |||
| STD3 | 19.125 | |||
| STD4 | 23.135 | |||
| STD5 | 26.625 | |||
| РНКсыз H2O | Белгисиз | — | — | — |
Fig.2 Оптималдуу рН
Fig.3 Оптималдуу температура
Fig.4 pH Туруктуулугу
Fig.5 Термикалык туруктуулук
Fig.6 Сактоо туруктуулугу 25℃
