Протеиназа K mNGS (суюктук)
Proteinase K кең субстрат өзгөчөлүгү менен туруктуу серин протеаза болуп саналат.Ал жуучу каражаттар болгон учурда да эне абалында көптөгөн белокторду бузат.Кристаллдык жана молекулярдык түзүлүштү изилдөөлөрдөн алынган далилдер ферменттин субтилизин үй-бүлөсүнө таандык экенин көрсөтүп турат (Asp)39- Анын69-Сер224).Бөлүнүүнүн басымдуу жери - блоктолгон альфа-амин топтору бар алифаттык жана ароматтык аминокислоталардын карбоксил тобуна чектеш пептиддик байланыш.Ал, адатта, анын кенен өзгөчөлүгү үчүн колдонулат.Бул протеиназа К mNGS үчүн атайын иштелип чыккан.Башка протеиназа К менен салыштырганда, ал mNGS ылдыйкы агымынын колдонулушун жакшыраак камсыз кыла турган, ошол эле ферменттик көрсөткүчтөргө ээ болгон нуклеин кислотасынын булганышын да аз камтыйт.
Сактоо шарттары
2-8℃ 2 жыл
Спецификация
| Көрүнүш | Түссүздөн ачык күрөңгө чейинки суюктук |
| Активдүүлүк | ≥800 U/мл |
| Протеиндин концентрациясы | ≥20 мг/мл |
| Nickase | Эч ким табылган жок |
| DNase | Эч ким табылган жок |
| RNase | Эч ким табылган жок |
Properties
| EC номери | 3.4.21.64(Tritirachium альбомунан рекомбинант) |
| Изоэлектрдик чекит | 7.81 |
| Оптималдуу рН | 7.0- 12.0 1-сүрөт |
| Оптималдуу температура | 65 ℃ 2-сүрөт |
| рН туруктуулугу | pH 4,5- 12,5 (25 ℃, 16 с) 3-сүрөт |
| Термикалык туруктуулук | 50 ℃ төмөн (рН 8,0, 30 мин) 4-сүрөт |
| Сактоо туруктуулугу | 25 ℃ температурада 12 ай бою 90%дан ашык активдүүлүк |
| Активаторлор | СДС, мочевина |
| Ингибиторлор | диизопропил фторофосфат;фенилметилсульфонил фториди |
Тиркемелер
1. Генетикалык диагностикалык комплект
2. РНК жана ДНК экстракциялоо комплекттери
3. Ткандардан белок эмес компоненттерди экстракциялоо, ДНК сыяктуу белок аралашмаларын бузуувакциналар жана гепарин даярдоо
4. Импульстук электрофорез аркылуу хромосоманын ДНКсын даярдоо
5. Western blot
6. In vitro диагностикасы үчүн ферменттик гликозилденген альбумин реагенттери
Cактык чаралары
Колдонууда же таразалоодо коргоочу кол каптарды жана көз айнектерди кийиңиз жана колдонгондон кийин жакшы желдетип туруңуз.Бул продукт теринин аллергиялык реакциясын жана олуттуу көздүн кыжырдануусун жаратышы мүмкүн.Дем алган болсо, ал аллергия же астма симптомдорун же дем алуусун келтириши мүмкүн.Дем алуу органдарынын кыжырдануусун пайда кылышы мүмкүн.
Бирдиктин аныктамасы
Бир бирдик (U) 1 мкмоль өндүрүү үчүн казеинди гидролиздөө үчүн зарыл болгон ферменттин көлөмү катары аныкталат.төмөнкү шарттарда мүнөтүнө тирозин.
Реагенттерди даярдоо
I реагент: 1 г сүт казеин 50 мл 0,1 М натрий фосфат эритмесинде (рН 8,0) эритилип, 65-70 ℃ сууда 15 мүнөт инкубацияланды, аралаштырылды жана эритилди, суу менен муздатылды, натрий гидроксиди менен pH 8,0гө чейин жөндөлдү жана бекитилген көлөмдө, 100мл.
II реагент: 0,1М трихлорасетат кислотасы, 0,2М натрий ацетаты, 0,3М уксус кислотасы.
Реагент III: 0,4M Na2CO3чечим.
IV реагент: Форинт реагенти таза суу менен 5 жолу суюлтулган.
V реагент: Фермент эриткичи: 0,1 М натрий фосфат эритмеси (рН 8,0).
VI реагент: тирозин эритмеси: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 умол/мл тирозин 0,2 менен эритилгенM HCl.
Процедура
1. 0,5 мл реагент I 37 ℃ чейин жылытылат, 0,5 мл фермент эритмесин кошуп, жакшылап аралаштырып, инкубациялоо керек.37 ℃ 10 мүнөт.
2. Реакцияны токтотуу үчүн 1 мл реагент II кошуп, жакшылап аралаштырып, 30 мүнөт инкубациялоону улантыңыз.
3. Реакция эритмесин центрифугалоо.
4. 0,5 мл супернатантты алып, 2,5 мл реагент III, 0,5 мл реагент IV кошуп, жакшылап аралаштырып, 37℃ температурада инкубациялаңыз.30 мүнөткө.
5. ОД660ОД деп аныкталган1;бош башкаруу тобу: 0,5 мл реагент V ферментти алмаштыруу үчүн колдонулатOD аныктоо үчүн чечим660катары OD2, ΔOD=OD1-OD2.
6. L-тирозиндин стандарттык ийри сызыгы: 0,5 мл ар кандай концентрациядагы L-тирозин эритмеси, 2,5 мл реактив III, 5 мл центрифугалык түтүктөгү 0,5 мл реагент IV, 37 ℃ температурада 30 мүнөт инкубациялоо, OD үчүн аныктоо660L-тирозиндин ар кандай концентрациясы үчүн, андан кийин Y=kX+b стандарттык ийри сызыгы алынган, мында Y L-тирозин концентрациясы, X – OD600.
Эсептөө
2: Реакция эритмесинин жалпы көлөмү (мл)
0,5: Фермент эритмесинин көлөмү (мл)
0,5: хромогендик аныктоодо колдонулган суюктуктун реакциясынын көлөмү (мл)
10: Реакция убактысы (мин)
Df: Көп суюлтуу
C: Фермент концентрациясы (мг/мл)
Шилтемелер
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.Биофиз.Res.Коммун.(1971);44:513.
3. Хилз, Х.жана башкалар.,евро.J. Биохим.(1975);56:103–108.
4. Сэмбрук Джet ал., Молекулярдык клондоо: Лабораториялык колдонмо, 2-басылышы, Cold Spring HarborЛабораториялык басма, Cold Spring Harbor (1989).
Фигуралар
Fig.1 Оптималдуу pH
100мМ буфердик эритме: pH6.0-8.0, Na-фосфат;pH8.0-9.0, Tris-HCl;pH9.0-12.5, Глицин-NaOH. Фермент концентрациясы: 1мг/мл
Fig.2 Оптималдуу температура
20 мМ К-фосфат буфериндеги реакция pH 8.0.Фермент концентрациясы: 1 мг/мл
Fig.3 pH Туруктуулук
25 ℃, 16 саат 50 мМ буфердик эритме менен дарылоо: pH 4,5- 5,5, Ацетат;рН 6,0-8,0, Na-фосфат;pH 8.0-9.0, Tris-HCl.рН 9,0-12,5, Глицин-NaOH.Фермент концентрациясы: 1 мг/мл
Fig.4 Термикалык туруктуулук
50 мМ Tris-HCl буфери, рН 8.0 менен 30 мин-дарылоо.Фермент концентрациясы: 1 мг/мл
Fig.5 Сактоо туруктууty at 25℃
