Hotstart Taq ДНК Полимераза
Hot Start Taq ДНК Полимераза (Антитело модификациясы) 5′→3′ полимераза активдүүлүгүнө жана 5′ флап эндонуклеаза активдүүлүгүнө ээ болгон Thermus aquaticus YT-1ден чыккан ысык башталгыч термостабилдүү ДНК полимеразасы.ысык баштоо Taq ДНК полимераза thermolabile Taq антителолор менен өзгөртүлгөн Taq ДНК полимераза болуп саналат.Антителолордун модификациясы ПТРдин өзгөчөлүгүн, сезгичтигин жана түшүмүн жогорулатты.
Компоненттер
| Компонент | HC1012A-01 | HC1012A-02 | HC1012A-03 | HC1012A-04 |
| 5×HC Taq буфери | 4×1 мл | 4×10 мл | 4×50 мл | 5×400 мл |
| Hot Start Taq ДНК Полимераза (Антитело өзгөртүлгөн) (5 U/мкл) | 0,1 мл | 1 мл | 5 мл | 10×5 мл |
Тиркемелер
10 mM Tris-HCl (pH 7,4 at 25℃), 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol, 0,5% Tween20, 0,5% IGEPALCA-630 жана 50% Glycerol.
Сактоо абалы
0 ° C астында ташуу жана -25 ° C ~ -15 ° C сакталат.
Бирдиктин аныктамасы
Бир бирдик 75°С температурада 30 мүнөттө кислотада эрибеген материалга 15 нмоль dNTP киргизген ферменттин саны катары аныкталат.
Сапатты көзөмөлдөө
1.Endонуклеаза активдүүлүгү:20 U ферментти 4 мкг pUC19 ДНК менен 4 саат бою 37℃ температурада инкубациялоо гель электрофорези менен аныкталгандай ДНКнын деградациясын аныктоого мүмкүн болгон жок.
2.5 кб Ламбда ПТР:200 мкМ dNTPs жана 0,2 мкМ праймерлердин катышуусунда 1,25 бирдик Так ДНК Полимераза менен 5 нг Ламбда ДНКсынын ПТР күчөтүүнүн 25 цикли күтүлгөн 5 кб продуктту берет.
3.Экзонуклеазанын активдүүлүгү:10 нмоль 5´-FAM олигонуклеотиди менен 12,5 Удан кем эмес Так ДНК полимеразасын камтыган 50 мкл реакцияны 37 ℃ температурада 30 мүнөт инкубациялоо эч кандай аныкталуучу деградацияны бербейт.
4.RNase Activity:20 U ферментти камтыган 10 мкл реакцияны 1 мкг РНК транскрипттери менен 2 саат бою 37°Cде инкубациялоо гель электрофорези менен аныкталгандай РНКнын деградациясын аныктоого мүмкүн болгон жок.
5.Жылуулукту инактивациялоо:Жок.
Реакция системасы
| Компоненттер | Көлөм |
| Үлгү ДНКa | кошумча |
| 10 μM Forward Primer | 0,5 мкл |
| 10 мкм тескери праймер | 0,5 мкл |
| dNTP Mix (ар бири 10мМ) | 0,5 мкл |
| 5×HC Taq буфери | 5 мкл |
| Так ДНК полимеразаб(5U/мкл) | 0,125 мкл |
| Нуклеазсыз суу | 25 мкл чейин |
Эскертүүлөр:
1) а.
| ДНК | Суммасы |
| Геномиялык | 1 нг-1 мкг |
| Плазмиддик же вирустук | 1 pg-1 нг |
2) б.Так ДНК Полимеразанын оптималдуу концентрациясы адистештирилген колдонмолордо 5-50 бирдик/мл (0,1-0,5 бирдик/25 мкл реакция) чейин өзгөрүшү мүмкүн.
Термикалык цикл протоколу
ПЦР
| Кадам | Температура(°C) | Убакыт | Циклдер |
| Баштапкы денатурацияa | 95 ℃ | 1-3мин | - |
| Денатурация | 95 ℃ | 15-30 с | 30-35 Циклдер |
| Жылуулооб | 45-68 ℃ | 15-60 с | |
| Кеңейтүү | 68 ℃ | 1кб/мүнөт | |
| Акыркы узартуу | 68 ℃ | 5мин | - |
Эскертүүлөр:
1) 95°Сте 1 мүнөттүк баштапкы денатурация көпчүлүк күчөтүү үчүн жетиштүү.Кыйын шаблондор үчүн 95°Cде 2-3 мүнөткө созулган денатурация сунушталат.Колониялык ПТР менен 95°C денатурациялоону 5 мүнөттүк баштоо сунушталат.
2) Күйүү кадамы адатта 15-60 с.Күйүү температурасы праймер жуптун Tm негизинде түзүлөт жана адатта 45-68 ℃ болот.
